基于网络药理学探讨肉苁蓉治疗血管性痴呆的作用机制

陈静',唐秀松'，吴林'，陈炜2,王清碧3,李鹏4

(1.广西中医药大学，广西南宁530001；2,广西中医药大学第一附属医院，广西南宁530023；

3.广西中医药大学附属瑞康医院，广西南宁530011；4,济宁市中医院，山东济宁272100)

摘要：目的基于网络药理学探讨肉苁蓉治疗血管性痴呆(vascular dementia,VD)的作用机制。方法采用TCMSP分析平台检索中药活性成分和中药靶点，利用GeneCards数据库和0MIM数据库筛选肉苁蓉治疗VD的作用靶点，构建蛋白互作网络(PPI)，进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，构建可视化的中药-疾病靶点相关的信号通路。结果从肉苁蓉中筛选出4个有效成分,作用于60个血管性痴呆靶点，肉苁蓉治疗VD的核心基因主要有IL6、VEGFA、EG-FR、CASP3、MYC、CCND1、FOS、PPARG、AR、RELA、NOS3、ICAM1等。中药-疾病靶点涉及的GO功能主要包括DNA结合转录激活活性、核受体活性、转录因子活性，直接配体调节的序列特异性DNA、乙酰胆碱受体活性、泛素蛋白连接酶结合、RNA聚合酶II转录因子结合等。中药-疾病靶标涉及的KEGG通路主要包括流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、前列腺癌信号通路、糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、癌症中的蛋白多糖信号通路、PI3K-Akt信号通路、肝细胞癌信号通路、细胞凋亡信号通路、丙肝信号通路等。结论基于网络药理学探讨了肉苁蓉治疗血管性痴呆的分子机制，为中药现代化研究提供了理论基础。

关键词：肉苁蓉；血管性痴呆；网络药理学；作用机制；蛋白互作网络

中图分类号:R277.749.13文献标志妈:A文章编号：1673-7717(2021)02-0156-06

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是一种由脑缺血、缺氧或者出血所引起的行为、记忆等严重认知功能障碍综合征!，_21o其典型临床表现为具有脑卒中病史，在脑卒中后3个月内出现明显的认知记忆功能障碍F。VD发病率随着全球人口老龄化加剧而逐渐增加，成为继阿尔茨海默病(Alzheimer,s disease,AD)后的第二大痴呆类型"I给家庭和社会带来沉重的经济负担。到目前为止尚未有被美国食品药品管理局(The US Food and Drug Administration,FDA)批准用于VD的临床治疗药物，目前主要以改善脑循环、抗血小板聚集、调脂稳斑等治疗原发性血管性疾病，多用多奈哌齐、毗拉西坦等胆碱酯酶抑制剂改善记忆减退情况［5_610由于VD是目前唯一可以预防的痴呆类型⑺，在无西药专药治疗该病的现实下，从中医药中寻找有效防治VD药物是目前医学硏究的重点。

近年来，很多研究表明中药能够改善VD症状。李强等&运用“中医传承辅助系统”对VD方药组成进行数据挖掘分析，发现肉苁蓉出现频次较多。肉苁蓉，学名；Cistanches Herba Ma,别名寸芸，列当科植物肉苁蓉Cistanches Herba Y.C.Ma或管花肉苁蓉Cistanche tubulosa(Schrenk)Wight干燥带鳞叶的肉质茎，素有“沙漠人参”之美誉,其性温，味甘，咸；归肾、大肠经，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效。有研究报道，肉灰蓉富含螢醇、木脂素类、苯乙醇首类、环烯酰葩类等有效成分，可有效改善老年痴呆患者的认知功能&，但对改善VD患者认知功能的机制仍未完全明确。研究肉苁蓉中有效成分治疗VD的作用机制具有重要意义。

中药复方具有令人信服的疗效，但其多靶点、多成分、多途径的共同作用特点,使得我们很难明确何种成分在治疗疾病中起到主要作用M。网络药理学是一门基于生物信息学、分子生物学及各大数据库信息系统的学科，综合分析中药成分作用于疾病的共同靶标，深入分析靶标涉及的基因、蛋白、信号通路,与中药多成分-多靶点的特点是相统一的'"-I21o本研究基于网络药理学探讨肉苁蓉治疗VD的作用机制。

1资料

本研究使用相关分析平台和数据库见表lo

2方法

2.1筛选肉苁蓉中有效成分和靶点本研究通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform)，以肉苁蓉为关键词搜索其全部活性成分。然后以为口服生物利用度(oral bioavailability,OB)>30%，药物类药性(drug likeness,DL)>0.18为筛选条件，见表2。釆用Perl软件对相关有效成分作用靶点进行预测。

2.5构建中药-有效成分-疾病-靶点调控网络将2.2获得的肉苁蓉靶点和2.4获得的肉苁蓉-VD靶点利用Perl软件进行一一映射，然后运用Cytoscape软件对该网络进行拓扑计算,得到中药-成分-疾病-靶点调控网络。见插页刼图2。

其中节点的类型有中药、有效成分、疾病和中药一疾病靶点。

2.6构建中药-疾病靶点蛋白相互作用网络与筛选核心基因利用STRING在线软件将中药一疾病靶点输入软件,筛选条件为种属选择homo sapiens,保存结果文件见插页XM图3将所得文件输入R语言计算，得到蛋白互作网络核心靶点的条图。见图4

2.7 G。功能富集分析和KEGG通路富集分析将中药-疾病靶点利用R语言软件计算，得到GO功能富集分析（插页烦图5、插页XX1H图6）和KEGG通路富集分析（插页XXJ1图7~图8）。

3结果

3.1肉苁蓉中有效成分的筛选和靶点预测结果通过对TC-MSP数据库中肉苁蓉所有有效成分及其相关靶点筛选，共捜索到有效成分75个，相关靶点658个,根据0B和DL标准对肉芨;蓉的有效成分进行筛选，共获得有效成分6个，有效成分对应的靶点224个。

3.2中药-疾病靶点构建的结果利用R语言软件将VD疾病相关靶点与肉苁蓉靶点取交集，得到中药-疾病共同靶点的韦恩图（图1）,从中得到中药-疾病靶点6（）个。其中VD疾病相关靶点3047个，肉苁蓉靶点85个；

3.3构建中药-有效成分-疾病-靶点调控网络的结果插页制图2中红色代表血管性痴呆（VD）,绿色代表中药肉苁蓉，紫色代表肉苁蓉的有效成分，蓝色代表肉苁蓉-VD疾病共同靶点。中药肉苁蓉主要通过4种有效成分作用于60个靶点，这60个靶点可能影响VD的发生

3.4构建中药-疾病靶点蛋白相互作用网络与筛选核心基因的结果据图4可知，中药-疾病核心基因按邻接节点数目由多到少依次为：IL6、VEGFA、EGFR、CASP3、MYC、CCND1、FOS、PPARG、AR、RELA、NOS3、ICAM1、HIFA、AHR、CAV1、PGR,CASP8、NFKB1A、CASP9、VC AMI,NFE2L2、RBI、HSPB1、IGF2、PARP1、CRP、CYP3A4、IGFBP3、NQO1、PLAU。邻接节点数目越多,成为核心基因的概率越大。

图4中药-疾病核心靶点的条图

左列为基因名，如1L-6（interleukin-6,白介素-6）,数字为相应基因邻接节点数目，如IL-6邻接节点数目为40。

3.5 GO功能富集分析肉苁蓉治疗VD的核心靶点的GO功能富集分析结果见插页XXi图5~插页XXII图6。肉苁蓉治疗VD的核心基因的GO功能主要涉及DNA结合转录激活活性、激活转录因子结合、核受3.5体活性、转录因子活性，直接配体调节的序列特异性DNA、乙酰胆碱受体活性、泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合、RNA聚合酶II转录因子结合、半胱氨酸型内肽酶活性与细胞凋亡的关系、类固醇激素受体、G蛋白偶联胺受体活性、激酶调节活性、整合素结合、抑制转录因子结合等。

柱状图:插页Nl图5左侧字母为GO名称,下面数字为富集在GO上的基因数目，柱状图形表示富集在GO上的基因,P代表富集的显著性，颜色越红，富集的程度越高,相应的P值越小。

气泡图:插页XXin图6左侧字母为GO名称，下面数字为基因的比例，大小表示富集的基因的数目，颜色代表P值,颜色越红，富集的程度越高,相应的P值越小。

3.6KEGG通路富集分析肉苁蓉治疗VD的核心靶标的KEGG通路富集分析结果见插页XH图7~图8,肉苁蓉治疗VD的核心基因的KEGG通路主要涉及:流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、前列腺癌信号通路、糖尿病并发症中的年龄-年龄信号通路、人巨细胞病毒感染信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、肺小细胞癌信号通路、癌症中的蛋白多糖信号通路、PI3K-Akt信号通路、肝细胞癌信号通路、细胞凋亡信号通路、丙肝信号通路等。

柱状图:插页xxm图7左侧字母为KEGG名称，下面数字为富集在KEGG上的基因数目，柱状图形表示富集在KEGG上的基因,P代表富集的显著性，颜色越红，富集的程度越高，相应的P值小。

气泡图:插页XXII图8左侧字母为KEGG名称，下面数字为基因的比例，圆圈大小表示富集的基因的数目，颜色代表F值，颜色越红，富集的程度越高,相应的P值越小。

4讨论

现代研究显示，肉苁蓉具有神经免疫调节、抗疲劳、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等多种药理活性o本研究利用网络药理学对肉苁蓉治疗血管性痴呆的作用机制进行探讨-网络药理学是一种包括网络分析、系统生物学和多效性的药物设计方法"结合中医药“整体观念”的理论，全面分析中药成分作用于疾病的靶点,对于研究中药治疗疾病的作用机制具有深远意义。

本研究表明，肉苁蓉的主要有效成分可通过多靶标、多通路影响VD的发生。肉苁蓉治疗VD的核心基因主要有IL6、VEGFA、EGFR、CASP3、MYC、CCND1、FOS、PPARG、AR、RELA、NOS3 JCAM1等,这些基因可通过影响DNA结合转录激活活性、激活转录因子结合、核受体活性、转录因子活性，直接配体调节的序列特异性DNA、乙酰胆碱受体活性、泛素蛋白连接酶结合、RNA聚合酶II转录因子结合、半胱氨酸型内肽酶活性与细胞凋亡的关系、类固醇激素受体、G蛋白偶联胺受体活性、激酶调节活性、整合素结合、抑制转录因子结合等来调控VD的发生，即主要从炎症因子、细胞因子等分子水平来治疗VD,炎症因子可损伤脑白质细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和周细胞)，细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)能加快斑块脱落,导致脑血管堵塞,增加二次脑卒中风险，进而使患VD概率增加面。研究发现,IL-6(interleukin6,白细胞介素-6)是一种多功能的细胞因子IL-6升高与认知功能下降、脑血管疾病关联性很大,它参与VD发病的病理过程。VEGF在缺血性脑血管病的微循环重建中发挥关键的作用，是目前最强的促血管生长因子,能促进新生毛细血管的形成，提高机体输氧能力和氧交换面积，减轻缺氧对人体的伤害O

肉苁蓉治疗VD的核心基因的KEGG通路很多，这些通路主要包括流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、前列腺癌信号通路、糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路、人巨细胞病毒感染信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、肺小细胞癌信号通路、癌症中的蛋白多糖信号通路、PI3K-Akt信号通路、肝细胞癌信号通路、细胞凋亡信号通路、丙肝信号通路等。前列腺癌信号通路的下游通路包括凋亡信号通路。解恒革"对睾丸切除术患者(包括认知功能正常者、MCI、AD、VaD)进行研究，结果发现痴呆患者岀现血清睾酮和EZ的下降，与痴呆严重程度密切相关。T和EZ对认知功能的影响依认知功能是否受损而不同一动脉粥样硬化信号通路的下游通路包括NFkB信号通路、MAPK信号通路、凋亡信号通路等。张海燕研究发现五脏温阳化瘀汤能改善动脉粥样硬化VD大鼠学习记忆能力，其作用机制可能与抑制动脉粥样硬化VD大鼠的氧化应激反应。王晋平等〔由通过动物实验发现益肺宣肺降浊方能提高cAMP含量，促进PKA表达(F<0.05),改善VD大鼠学习记忆功能和空间探索能力，减少神经细胞凋亡。

综上所述，肉苁蓉多种有效成分通过调控VD相关的基因起到治疗VD的作用。网络药理学为发现新信号通路,调控富集程度高的基因和信号通路来治疗疾病以及全面认识中药和疾病的关系拓宽了渠道。本研究可为肉苁蓉治疗VD提供一定的依据，也可为临床治疗VD及新型药物的开发提供思路。

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