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肉苁蓉苯乙醇苷类成分对BSA诱导的肝纤维化大鼠转化Th长因子β1表达的影响

由淑萍1，赵军2，木克热木·吐地买提1，马龙1，张石蕾1，刘涛1

2021-09-14

肉苁蓉苯乙醇苷类成分对BSA诱导的肝纤维化大鼠转化Th长因子β1表达的影响

由淑萍1，赵军2，木克热木·吐地买提1，马龙1，张石蕾1，刘涛1，*

（1.新疆医科大学公共卫生学院毒理学教研室，新疆乌鲁木齐830011；2.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆乌鲁木齐830004）

【摘要】目的：观察肉苁蓉苯乙醇苷类成分(CPhGs)对牛血清白蛋白(BSA)诱导的免疫性肝纤维化大鼠肝组织转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响，探讨其治疗肝纤维化的效果及机制。方法：将75只SD大鼠随机分为6组，即正常对照组，肝纤维化模型组，阳性对照组(复方鳖甲软肝片600 mg/kg)，以及CPhGs高(500 mg/kg)、中(250 mg/kg)、低(125 mg/kg)剂量组。CPhGs高、中、低剂量组每组各13只，其余每组各12只。采用皮下及尾静脉注射BSA诱导建立大鼠肝纤维化模型，造模同时灌服相应剂量的受试药物，正常对照组和模型组灌胃给予蒸馏水，其余各组均按设定剂量灌胃给药；给药结束后收集大鼠血清、肝组织，采用全自动生化仪检测大鼠肝功能酶指标，包括血清白蛋白(ALB)、血清总胆红素(TB)、血清直接胆红素(DB)水平；放射免疫法检测血清肝纤维化标志包括血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)含量；ELISA测定血清TGF-β1水平；Masson染色观察肝脏病理组织学变化；免疫组化法测定肝组织中TGF-β1的表达。结果：与模型组相比，CPhGs各剂量组肝纤维化大鼠血清中ALB含量增加，中、高剂量组TB、DB含量降低，各剂量组大鼠肝纤维化指标含量均明显降低(P<0.05或P<0.01)，血清TGF-β1含量降低(P<0.01)，Masson染色结果显示CPhGs各剂量组肝纤维化程度减轻，均显著低于模型组(P<0.01)，各剂量组肝组织中TGF-β1蛋白的表达也明显受到抑制(P<0.05或P<0.01)。结论：CPhGs对BSA诱导的免疫性肝纤维化大鼠具有较好的保护作用，对TGF-β1表达的抑制作用可能是其作用机制之一。

【关键词】肉苁蓉；苯乙醇苷类；肝纤维化；牛血清白蛋白；转化生长因子β1

中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1004-616X(2015)06-0409-06 doi:10.3969/j.issn.1004-616x.2015.06.001

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是肝脏遭受反复或慢性损伤后的一种损伤与修复过程，主要与慢性炎症和引起慢性肝脏损伤的化学因素相关[1-3]，已成为一个发病率和死亡率都很高的世界医学难题，各种肝病多数经肝纤维化最后发展为晚期肝硬化，成为肝病死亡的主要原因[4]。目前研究已经明确：肝纤维化是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成与降解失衡的动态过程；肝纤维化及早期肝硬化是完全可逆转的[5]。

中医药治疗肝纤维化有悠久的历史和肯定的临床疗效，研究证实，中医药治疗肝纤维化具有多靶点、多环节、多途径复合作用的特点。肉苁蓉(cistanche)是著名的名贵补益类中药。因其疗效确切，药性温和，所以自古就被视为强壮、滋补的中药，有“沙漠人参”之美誉，化学及药理作用研究显示肉苁蓉苯乙醇苷类(cistanche phenylethanoid glycosides，CPhGs)成分是其发挥药效的主要物质基础之一[6]。CPhGs具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和免疫调节等多种生物活性[7-11]。Peter等[12]于1989年首次发现苯乙醇苷类化合物松果菊苷具有显著的保肝护肝作用，随后引起人们对CPhGs进行抗肝炎研究的兴趣，本文通过建立牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)诱导的免疫肝纤维化大鼠模型，观察CPhGs对大鼠血清肝功能、肝纤维化指标、病理学变化及血清与肝组织中TGF-β1表达的影响，以期阐明CPhGs抗肝纤维化的可能作用机制，为进一步的新药开发提供基础数据。

1材料

1.1主要试剂与仪器

管花肉苁蓉新鲜肉质茎6.0 kg，经70%乙醇热回流提取3次，每次3 h，合并提取液。AB-8树脂纯化得到提取物即苯乙醇苷的乙醇提取物，后经新疆维吾尔自治区药物研究所赵军研究员鉴定为CPhGs，纯度为70%。用0.5%的羧甲基纤维素钠(sodium carboxyl methyl cellulose-Na，CMC-Na)将其配制成不同浓度，置4℃冰箱保存待用。

复方鳖甲软肝片(内蒙古福瑞科技股份有限公司产品)，BSA(Sigma公司产品)。羊毛脂(上海源叶生物科技公司)，液体石蜡(天津市富宇精细化工有限公司)，磷酸盐缓冲液(飞世尔生物化学制品北京有限公司)。大鼠转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)夹心ELISA试剂盒(联科生物技术有限公司)，兔抗TGF-β1抗体0.2 mL(BIOSS公司)。

电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，L-530多管架自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，全自动生化分析仪(迈瑞公司)，化学发光分析仪(泰格科信)。

1.2方法

1.2.1动物雄性健康SD大鼠75只，SPF级，体质量180～220 g，由新疆医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号为SCXK(新)2011-0004。SPF级实验动物使用许可证号为SYXK(新)2011-0004。

1.2.2分组及给药将SD大鼠随机分为6组，即正常对照组，肝纤维化模型组，阳性对照组(复方鳖甲软肝片600 mg/kg)，以及CPhGs高(500 mg/kg)、中(250 mg/kg)、低(125 mg/kg)剂量组。CPhGs高、中、低剂量组每组各13只，其余每组各12只。除正常组外，大鼠采用朱启贵等[13]的方法制备免疫性肝纤维化模型：造模分为致敏阶段和尾静脉攻击阶段。致敏阶段，除正常对照组注射生理盐水(每只0.5 mL)以外，其余各组动物均多点皮下注射含弗氏不完全佐剂的9 mg/mL BSA，每次0.5 mL，共5次。前两次注射间隔为14 d，后3次注射间隔为7 d。末次致敏注射后1周，每只动物于眼球后静脉丛采血，采用双向扩散法检测大鼠血清抗BSA抗体。抗体阳性大鼠继续进行尾静脉攻击，即模型组和给药组大鼠尾静脉注射BSA，每周2次，连续5周，注射剂量由每只2 mg逐渐递增至4 mg；正常对照组尾静脉注射生理盐水。造模同时给药，除空白对照组和模型组灌胃给予蒸馏水外，其余各组均按设定剂量灌胃给药；造模结束后继续给药4周，实验周期共计15周。

1.2.3血清各项指标含量的检测各组大鼠于末次给受试物后禁食(不禁水)24 h，称体质量，经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉、腹主动脉取血，3 000 r/min离心10 min分离血清，全自动生化仪检测3项肝功能酶指标，包括血清白蛋白(serum albumin，ALB)、血清总胆红素(total bilirubin，TB)、血清直接胆红素(direct bilirubin，DB)含量；双抗体夹心酶联免疫法，测定血清TGF-β1水平；化学发光免疫分析仪检测肝纤维化4项即血清透明质酸(clolinesterase，HA)、层黏连蛋白(1aminin，LN)、Ⅲ型前胶原(prcocollagen typeⅢ，PCⅢ)、Ⅳ型胶原(typeⅣcollagen，Ⅳ-C)水平。

1.2.4肝脏组织病理学观察所有大鼠均取同一部位肝组织，用40％的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片并进行Masson染色，显微镜下观察组织学变化。肝纤维化分级参照文献[14]分为5级：0级，无纤维化；I级，纤维结缔组织仅限于汇管区或汇管区有扩大，有向小叶发展的倾向；II级，纤维结缔组织增生明显，超过小叶的2/3并伴有I级改变；Ⅲ级，纤维结缔组织进入肝小叶中央静脉周围；IV级，纤维结缔组织在全小叶呈多处弥漫性增生，有假小叶形成，并有Ⅲ级改变。

1.2.5肝脏组织TGF-β1表达的检测组织切片用Nikon Digital Sightds-Fi2型生物显微镜进行观察，并用K12320型显微摄像系统在低倍镜(×100倍)下选取清晰视野拍照。采用Motic Med 6.0 CMIAS彩色图像分析软件，通过显微摄像系统放大200倍，每张切片随机选取3个视野，每个视野随机选取5个2 cm×3 cm大小的区域，TGF-β1免疫组化阳性反应产物为出现位于细胞浆的棕黄色细颗粒状染色，测定其平均光密度值(MOD)，值越大表明组织中该抗原含量越高。计算公式如下：MOD=胶原面积/肝组织面积×100%。

1.3统计学方法

用SPSS 16.0软件进行统计学分析，数据采用x-±s表示；多组间均数比较采用方差分析One-way ANOVA，多组样本均数两两比较采用LSD方法分析，有序分类资料采用Ridit分析，检验水准α=0.05。

2结果

2.1CPhGs对BSA致肝纤维化大鼠肝功能酶指标的影响

与正常对照组比较，肝纤维化模型组ALB含量明显降低，TB、DB含量明显增加，差异均具有统计学意义(P均<0.01)。与肝纤维化模型组比较，阳性对照组和CPhGs高、中、低剂量组大鼠血清ALB含量显著增加，差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；阳性对照组和CPhGs高、中剂量组大鼠血清TB、DB含量均显著降低，差异均具有统计学意义(P均<0.05)；同时，CPhGs各剂量组对于TB、DB活性存在一定的剂量依赖关系(r=0.666，r=0.749，P均<0.05)，提示CPhGs能够降低肝纤维化大鼠肝细胞的损害程度，改善肝纤维化大鼠肝功能，对肝细胞损伤具有保护作用，见表1。

TGF-β1是一个多功能的生长因子，目前被公认为是致纤维化最强有力的细胞因子之一，参与细胞的生长、分化及凋亡，刺激ECM的合成和沉积[23]，尤其TGF-β1在肝纤维化的发展中具有重要作用，可作为检测肝纤维化的重要标志物[24]，其表达水平与肝纤维化的严重程度呈显著正相关[25]。所以，通过检测TGF-β1的表达水平，可以明确肝纤维化病变产生的规律，并可进一步探究其逆转的机制。本研究以免疫组化图像分析检测TGF-β1的表达量后发现，CPhGs高剂量组的TGF-β1(免疫组化染色后阳性反应产物为出现位于细胞浆的棕黄色细颗粒)表达明显减弱，表达的面积缩小，颜色从棕黄色变为浅黄色；实验研究还发现，CPhGs高剂量组的TGF-β1表达量明显低于复方鳖甲软肝片组和模型组。我们分析结果后推测，可能由于CPhGs具有明显的降低TGF-β1表达量的作用，下调TGF-β1的表达，而抑制HSC活化、增殖，从而减少胶原合成，使ECM的合成减少，而达到抗肝纤维化的作用。

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