肉苁蓉苯乙醇总苷对血小板衍生生长因子诱导的肝星状细胞增殖的影响及机制

由淑萍1，赵军2，马龙1，张石蕾1，刘涛1

(1．新疆医科大学公共卫生学院，新疆乌鲁木齐830011;2．新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆乌鲁木齐830004)

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．09．009

文献标志码:A文章编号:1001－1978(2016)09－1231－05中国图书分类号:Ｒ-332;Ｒ284．1;Ｒ322．47;Ｒ329．24;Ｒ575．202．2;Ｒ977．6

摘要:目的探讨肉苁蓉苯乙醇总苷(CPhGs)抑制血小板衍生生长因子-BB(rrPDGF-BB)介导的大鼠肝星状细胞(HSC)增殖活化作用及对PDGF/EＲK1/2信号通路表达的影响。方法培养HSC细胞，体外给予不同浓度(0、3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00和500.00 mg·L－1)的CPhGs测定半数抑制率(IC)，选取25、50、75、100 mg·L－1的CPhGs，rrPDGF-BB刺激后，通过四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测细胞的增殖;采用荧光定量PCＲ(ＲT-PCＲ)检测EＲK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun和Collagen I mＲNA的表达;进一步采用Western blot法检测CPhGs对PDGF/EＲK1/2通路中EＲK1/2、P-EＲK1/2和Collagen I蛋白的表达。结果(50～100)mg·L的CPhGs可以抑制rrPDGF-BB诱导的HSC的100)mg·L的CPhGs可以抑制rrPDGF-BB诱导的HSC的抑制EＲK1/2、α-SMA、c-fos、c-jun和CollagenⅠmＲNA水平的表达，并且明显抑制EＲK1/2、P-EＲK1/2和CollagenⅠ通路蛋白的表达。结论CPhGs的抗肝纤维化作用可能与其阻断PDGF/EＲK1/2通路进而阻断HSC的活化、增殖有关。

关键词:肉苁蓉苯乙醇总苷;血小板衍生生长因子;肝星状细胞;肝纤维化;细胞增殖;信号通路;作用机制

肝纤维化是慢性肝病发展为晚期肝硬化的中间环节，由细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成与降解失衡所致，已成为肝病死亡的主要原因［1］。纤维化ECM产生于肌成纤维细胞(myofibroblast，MFB)，MFB主要来源于活化的肝星状细胞(hepaticstellate cells，HSC)［2－3］;因此，抑制HSC的激活，减少其增殖、活化是有效阻断肝纤维化发生、发展进程的重要途径，对预防肝硬化［4］、逆转肝纤维化的病程［5］具有重要的意义。肉苁蓉(Cistanche)是列当科肉苁蓉属，一种在沙漠树木梭梭根部的寄生植物，中国传统的名贵中药材，其主要成分中苯乙醇总苷(phenylethanol glycosides from cistanche tubulosa，CPhGs)［6］系发挥药效的主要物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多种生物活性。前期研究显示，CPhGs对牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)所致肝纤维化大鼠具有一定的防治作用［7－8］，血小板衍生生长因子(PDGF)-BB已被证实在刺激HSC生长和相关细胞间信号传递方面较为重要，本研究旨在观察CPhGs在rrPDGF-BB诱导的HSC细胞增殖中的作用及其对EＲK信号转导通路的影响。

1材料与方法

1．1试剂与仪器肉苁蓉苯乙醇总苷:管花肉苁蓉取自新疆吐鲁番地区，物种标本凭证存放于新疆省中药研究所，CPhGs由新疆维吾尔自治区药物研究所植物化学室提取纯化，纯度为70%，以含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培养液配成不同浓度的混悬液，经0.22μm滤器过滤后使用;大鼠HSC购自武汉Procell生物科技有限公司;Ｒecombinant rat PDGF-BB购自Peprotech公司;EＲK1/2、α-SMA、β-actin引物委托上海生工生物工程服务有限公司设计，经Genbank核实后合成;cDNA反转录试剂盒购自Thermo scientific公司;荧光定量PCＲ(real-time PCＲ，ＲT-PCＲ)试剂盒购自QIAGEN GmbH公司;β-actin单克隆抗体购自武汉Proteintech公司;p44/42MAPK(EＲK1/2)Antibody和Phospho-p44/42 MAPK(EＲK1/2)Antibody购自Cell signaling technology公司;CollagenⅠ(ab34710)抗体购自Abcam公司;碱性磷酸酶标记的二抗购自于美国Invitrogen公司;ＲIPA裂解液购自于Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 HSC的培养和传代和半数抑制率(IC50)HSC常规复苏后，用含10%的胎牛血清的DMEM(高糖)完全培养液，在37℃、5%CO2及饱和湿度下培养;当细胞呈单层致密状时，常规胰蛋白酶消化传代，24 h换液，72 h再传代;实验选用对数生长期细胞，以5×104·L－1接种于96孔板，24 h后换液，加入不同浓度组(0、3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00和500.00 mg·L－1)的CPhGs，每组4个复孔，作用48 h，MTT法于酶标仪490 nm测定吸光度A值并取均数，计算IC50。

有研究［14－15］发现HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达与EＲK1/2有关，抑制HSC EＲK1/2的活化或表达后，Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达将被抑制，EＲK1/2的表达随着肝纤维化的进展而明显增加，且与α-SMA的分布正相关［16］。因此以CPhGs作为干预药物，观察CPhGs对rrPDGF-BB刺激的HSC增殖活性、Ⅰ型胶原、EＲK1/2与α-SMA表达的影响，可能成为CPhGs治疗肝纤维化的作用靶点。本研究结果显示，50～100 mg·L－1浓度的CPhGs，对rrPDGF-BB刺激的HSC增殖活性具有明显的抑制作用，除25 mg·L－1浓度的CPhGs对rrPDGF-BB刺激的HSC EＲK1/2 mＲNA的表达无明显差异外，其余浓度组的CPhGs EＲK1/2及α-SMA mＲNA的表达均有明显抑制作用，对rrP-DGF-BB刺激的HSC EＲK1/2、p-EＲK1/2和CollagenⅠ蛋白表达也具有抑制作用，随CPhGs浓度的增加抑制作用增强。

肉苁蓉作为一种名贵的中药材，在推动新疆特色沙漠产业的发展中具有重要地位;本研究对CPhGs药物的抗肝纤维化作用及机制进行研究，显示CPhGs能够阻断PDGF介导的HSC的活化及增殖作用，同时抑制胶原纤维蛋白的分泌，这可能是通过CPhGs药物干扰PDGF/EＲK信号级联系统的相关信号分子及其磷酸化水平、抑制PDGF诱导的HSC活化和增殖来实现的。

(致谢:本实验主要在新疆医科大学第一临床医学院科技楼6楼细胞室及分子实验室完成，在此特别感谢实验室的负责老师及研究生同学的支持与帮助!)

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