肉苁蓉总苷对阿尔茨海默病模型大鼠学习认知功能和氧化应激的影响（一）

王璐1白雨朦2李晓宇3闫旭升4霍东升4宋嵬4杨占君4贾建新4

（包头医学院，1第三临床医学院，2巴彦淖尔临床医学院，3第一临床医学院，4人体解剖学教研室，包头014040）

摘要目的：探讨肉苁蓉总苷（GCs）对阿尔茨海默病（AD）模型大鼠学习认知功能的影响及其作用机制。方法：双侧脑室注射Aβ1-42制备AD大鼠模型，连续给予模型大鼠不同剂量的GCs腹腔注射20 d，Morris水迷宫检测各组大鼠空间学习记忆能力，尼氏染色观察海马CA1区细胞形态并计数正常锥体细胞；免疫组织化学测定脑组织突触素（SYN）含量、酶联免疫吸附试验测定血清超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性、丙二醛（MDA）的含量。结果：GCs可明显缩短逃避潜伏期与上台前路程，明显增加目标象限时间百分比与穿越平台次数；GCs能提高海马CA1区锥体细胞的存活率，明显增加SYN蛋白的表达和提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA的活性。结论：GCs改善AD学习认知障碍的机制可能是通过减少自由基堆积、清除体内过多的过氧化物，进而提高突触可塑性来改善学习认知功能。

关键词肉苁蓉总苷；阿尔茨海默病；突触可塑性；自由基；大鼠

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是发生在老年前期或老年期的一种慢性中枢神经系统退行性疾病；以进行性记忆减退、认知功能障碍及心理精神状态改变为主要临床表现[1]；以大脑皮质萎缩、突触神经元丢失、老年斑（senile plaques，SP）沉积及神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT）为主要病理改变[2]，关于其发病机制目前尚不明确。肉苁蓉（cistanch）为列当科植物，药效广泛，素有“沙漠人参”之美誉。肉苁蓉总苷（glycosides of cistanche，GCs）是肉苁蓉的主要提取物，包括苯乙醇苷类、环烯醚萜类、挥发性成分、木脂素类、多糖、生物碱等。研究显示，GCs具有改善AD相关学习认知功能障碍的药理作用[3-4]；但关于GCs改善学习认知的具体机制仍无定论，故研究GCs对AD模型大鼠学习认知功能的影响，并探讨其作用机制，以期为临床治疗AD提供实验依据。

1材料和方法

1.1实验动物及分组

雄性6月龄Wistar大鼠70只（购自内蒙古大学动物实验中心），饲养于清洁级环境，自由进食进水。将动物随机分为以下7组（10只/组）：空白对照组（Control）、溶剂对照组（Vehicle）、假手术组（Sham）、模型组（Model）、肉苁蓉总苷低剂量组（25 mg·kg-1·d-1）、中剂量组（50 mg·kg-1·d-1）、高剂量组（100 mg·kg-1·d-1）。空白对照组不给予任何处理；假手术组只进行侧脑室插管，但无液体注射；溶剂对照组侧脑室给予与模型组等体积的灭菌水；模型组给予双侧脑室可溶性Aβ1-42寡聚体注射（每侧10μg）；给药组给予模型动物肉苁蓉总苷对应剂量，肉苁蓉总苷用灭菌水进行溶解，调整药液浓度，保证各组给药体积相同。动物通过灌胃给药，灌胃给药1次/日，连续给药20 d。

1.2AD动物模型制备

1.2.1可溶性Aβ1-42寡聚体的制备

具体制备过程详见贾建新等[5]相关报道。将Aβ1-42粉末溶解于预冷的六氟异丙醇至浓度为1 mmol/L，而后分装到无菌微量离心管内。留取10μL作为聚合对照。用冷冻抽干机在真空条件下将Aβ溶液抽干后-80℃保存备用。聚合过程中先将抽干后的Aβ用二甲基亚砜溶解至5 mmol/L，再用预冷的F-12/DMEM培养基稀释至200μmol/L，4℃孵育24 h。4℃，14 000 r/min离心5 min，上清即为可溶性Aβ1-42寡聚体，将上清转移至新的EP管，4℃保存，去除离心管下方不溶的寡聚体。可溶性Aβ1-42寡聚体用前使用无菌PBS稀释至所用浓度（2μg/μL）。

1.2.2双侧侧脑室可溶性Aβ1-42寡聚体注射大鼠经2%戊巴比妥钠（40～60 mg/kg）腹腔注射麻醉，固定于脑立体定位仪，颅顶备皮，常规碘酒消毒。至两侧眼眶之间向后沿颅骨中线切开颅顶皮肤约1 cm，钝性分离皮下组织至颅骨外膜，反复用棉球擦拭切口，防止出血。充分显露矢状缝与冠状缝，暴露前囟（bregma）。参照大鼠脑图谱[6]，以前囟为始点，向后0.9 mm，中线左﹑右1.5 mm处在颅骨表面用印度墨水做标记点；用牙科电钻在标记点垂直颅骨表面进行打孔，开直径1 mm的骨窗，将微量注射器固定于脑立体定位仪的注射器夹持器上，垂直颅骨表面进针3.5 mm（以颅骨外表面为基点）。5 min内缓慢注入5μL Aβ1-42（2μg/μL），留针5 min使其充分扩散，最后缓慢撤出注射器，对侧进行相同操作。注射完毕后，松弛注射器夹持器螺母旋钮，将动物从定位仪上撤下。手术全程动物体温维持在36℃～37℃，动物于麻醉清醒前单独放置。动物造模完成后，回笼饲养7 d后鉴定模型制备是否成功。AD模型大鼠制备标准参照Christensen等[7]相关文献报道。

1.2.3蛋白标本、组织切片的存取和制备全程实验结束后，动物腹膜腔注射常规麻醉。各组半数动物断头取脑，拨取海马冻存于超低温冰箱以备后用。半数动物剪开胸腔暴露心，将注射器针头从心尖部刺入左心室，用剪刀快速剪开右心耳；随后无菌生理盐水灌注，4%多聚甲醛进行前固定，等待固定效果满意后终止灌注；断头开颅取脑并用4%多聚甲醛后固定24 h。修剪大脑组织块，选取上丘平面至视交叉的节段，常规脱水、透明、石蜡包埋。石蜡组织行冠状切片，制备片厚5μm的组织切片用于尼氏染色和免疫组织化学显色。

1.3Morris水迷宫测试（Morris water maze test，MWM test）定位航行实验历时5 d，每天训练4次。记录动物定位航行实验的逃避潜伏期、上台前路程及平均游泳速度。第6天进行空间探索实验，记录动物120 s内穿越平台的次数及在平台所在象限停留的时间百分比等指标。

1.4尼氏染色及细胞计数

各组选取相同海马CA1区截面的切片进行尼氏染色。每张切片在CA1区随机选取3个视野（200倍），计数1 mm长度内完整锥体细胞的个数，取其均数进行分析。

1.5免疫组织化学显色

切片脱蜡至水，3%过氧化氢孵育5～10 min，消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水洗5 min×3次，高压微波抗原热修复，PBS洗5 min×3次，10%山羊血清室温封闭30 min，滴加多克隆兔抗突触素（synaptophysin，SYN），4℃过夜，PBS洗5 min×3次，滴加生物素标记的二抗，37℃孵育2 h，PBS洗5 min×3次，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，PBS洗5 min×3次，DAB显色2 min，自来水洗，苏木精复染，上行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。

1.6酶联免疫吸附试验（ELISA）

各组动物实验全部结束后，10%水合氯醛（0.35mL/100 g）溶液经腹膜腔注射麻醉。用一次性注射器从动物尾静脉抽取1 mL全血留置于EP管中，放入冰盒。随后低温离心机4℃离心15 min（5 000 r/min），取血清100μL备用。检测血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量。ELISA操作步骤根据制造商试剂盒说明书（南京建成生物技术公司）进行。

参考文献：贾建新，宋嵬，闫旭升，等.肉苁蓉总苷对SAMP8小鼠空间学习记忆的影响及其机制[J].包头医学院学报，2014，30（6）：6-8.

罗兰，吴小川，高惠静.肉苁蓉总苷对阿尔兹海默病模型大鼠的保护作用研究[J].中国药房，2013，24（23）：2122-2124.

薛海燕，焦婵媛，姚军.肉苁蓉总苷药理作用的研究现状[J].中国临床药理学杂志，2018，34（4）：486-488.

吾买尔江•牙合甫，姚刚.肉苁蓉功效的实验研究进展[J].湖南中医杂志，2016，32（4）：193-196.

于连云.肉苁蓉的药理作用及临床应用[J].内蒙古中医药，2016，35（4）：87-88.

赵新杰，夏华玲，王苏静.肉苁蓉的药理作用研究进展[J].中国药业，2009，18（17）：77-79.等。