肉苁蓉总苷对喹啉酸所致A lzheimer病小鼠学习记忆的影响及其作用机制

刘凤霞*,王晓雯,王雪飞

(新疆医科大学基础医学院解剖学教研室,新疆乌鲁木齐830054)

摘要:目的:探讨肉苁蓉总苷(GC s)对喹啉酸(Q A)所致A lzheime r病(AD)模型小鼠学习记忆的影响及其作用机制。方法:采用一次性脑室内注射微量Q A造成A D小鼠模型。G Cs灌胃给药17 d,一次性训练被动回避跳台实验和Y型电迷宫空间分辨能力测试,测定小鼠学习记忆能力;按试剂盒说明测定脑组织丙二醛(M DA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、乙酰胆碱酯酶(T ChE)活性及谷胱甘肽过氧化物酶(G SH-Px)活性;电子显微镜检测脑组织钙离子含量;T U N EL法检测脑细胞凋亡。结果:GCs可降低Q A所致A D小鼠脑组织M DA含量,提高SO D、G SH-P x活性,降低T ChE活性,降低脑细胞凋亡率,减少脑组织中钙离子含量。结论:G Cs可提高QA所致AD小鼠学习记忆水平,对QA造成的脑损伤有保护作用;其机制可能与其增强自由基清除酶活性,减轻脂质过氧化反应,降低脑组织钙含量,抑制Q A诱导的脑细胞凋亡有关。

关键词:肉苁蓉总苷;A lzheime r病;喹啉酸;自由基

中图分类号:R-332;R965;Q 949.778.3文献标识码:A文章编号:1009-5551(2005)12-1131-05

Alzheime r病(A D)是老年期发生的一种以进行性认知障碍和记忆损害为主要特征的脑变性疾病。其病理改变以老年斑(senile plaques,SP)、神经纤维缠结(neurof ibril lary tangles,N FT)和神经元的丢失为主要特征[1]。脑室内注射喹啉酸(qui n-o li nic acid,QA)造成AD动物模型是公认的,可引起动物学习记忆减退和认知功能障碍,还可出现神经退化和死亡[2]。因此,此模型常用于AD发病机制的研究和药物筛选工具。肉苁蓉(Herba cistanches)俗名大芸,为列当科植物,是一味著名的补益中药,具有补肾阳、益精血、润肠通便、抗衰老、抗氧化等功效。肉苁蓉总苷(Glycosides o f cistanche,GCs)是新疆管花肉苁蓉中提得,主要成分是苯乙醇总苷。本课题组多年来已对GCs的抗氧化[3]、清除自由基[4]、抗衰老[5]等药理作用进行了深入的研究。本文旨在研究GCs对QA所致AD小鼠模型的学习记忆的影响,并探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1药品与试剂肉苁蓉总苷由新疆医科大学药学院植物化学室从北疆管花肉苁蓉中提得,主要成分是苯乙醇苷类;喹啉酸系Sigma化学公司产品;都可喜系SERVIER法国施雅药厂生产;考马司亮兰CBBG250试剂盒、丙二醛(MDA)含量测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性测定试剂盒,乙酰胆碱酯酶(TChE)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;细胞凋亡原位检测试剂盒为德国宝君曼公司产品。

1.2仪器LSY型电热恒温水浴锅(北京医疗设备厂生产),电子秤(北京塞多利斯天平有限公司生产),LYJ-Ⅲ型离心沉淀机(江苏响水医疗器械厂),721分光光度计(上海第三分析仪器厂),WH-851旋涡混合器(上海环球物化仪器厂),TN型托盘式扭力天平(上海第二天平仪器厂),M G-B型迷宫刺激器(张家港市三兴教学机械厂),XZ C-5A小白鼠刺激型跳台(张家港市三兴教学机械厂)。

1.3动物分组与模型制备KM种小鼠,体重(22±2)g,雄性,由新疆医科大学实验动物中心提供。随机分为6组:(1)假手术组;(2)喹啉酸组(模型组);(3)都可喜组(阳性对照组):8 mg/kg;(4)G Cs组(按GCs剂量高低分设3组):G CsⅠ组(62.5 mg/kg)、G CsⅡ组(125 mg/kg)、G CsⅢ组(250 m g/kg)。于造模手术前7 d开始灌胃给药,假手术组及模型组给蒸馏水,每天1次,共15 d。AD小鼠模型制备:实验动物用4水合氯醛10 ml/kg腹腔麻醉,从两耳连线与矢状缝交叉点处,在小鼠头部做长约0.8 cm的纵行切口,在前囟后2 mm左或右2 mm处,用5μl微量注射器垂直进针3 m m即为侧脑室,用0.01 mol/L(pH=7.4)PBS缓冲液配制的QA 2μl(含20 nmo l)缓慢注入侧脑室;假手术组注入0.01 mol/L(pH=7.4)P BS缓冲液2μl,注入时间2 min,留针2 min,起针局部消毒后缝合皮肤。

1.4观察指标及检测方法

1.4.1学习记忆能力测试(1)小鼠被动回避性跳台实验:装置为80 cm×16 cm×40 cm的茶色有机玻璃箱,箱底铺有铜栅作为刺激电极,内设高4.5 cm、直径6.5 cm的橡皮垫作为回避电击的安全平台。先放入小鼠适应5 min,随后通以36 V交流电,小鼠遭到电击后跳上安全平台,如从台上跳下,双足接触铜栅为错误反应。记录3 min内出现的错误反应次数。24 h后重测验,以小鼠学习和次日重测验(记忆)过程中出现的错误反应次数来评价学习记忆能力。(2)Y-电迷宫分辨学习能力检测:在暗室中进行,将小鼠移至暗室中适应30 min后开始训练,开始时先将小鼠放入Ⅰ臂端部,给予灯光信号使之适应60 s,然后在另外两臂中任一臂给予灯光信号,示为安全区,操纵电击控制器,予以90 V、10次/s的电刺激,以小鼠直接逃至安全区为正确反应。待小鼠逃至安全区后灯光继续亮15 s再熄灭,结束一次训练。此时该安全区作为一次训练的起步点,如此连续训练10次。记录正确次数。24 h后重测验,以小鼠学习和次日重测验(记忆)过程中出现的正确反应次数来评价学习记忆能力。

1.4.2生化指标测定于造模后10 d断头取脑,制成10脑匀浆,按试剂盒说明书测定SOD活性、M DA含量、GS H-P x活性及TChE活性。考马斯亮兰CBB-SDS法进行脑组织蛋白质含量测定。

1.4.3脑组织细胞凋亡率的测定采用T UNEL

法,光镜下观察结果。术后10 d断头取脑,用10甲醛溶液固定。石蜡切片,常规脱蜡脱水处理,滴加TUNE L反应混合物,37℃孵育60 min,滴加转化剂辣根过氧化物酶(PO D),37℃孵育30 min,滴加DAB底物溶液,室温孵育5～20 min,光镜下分析结果。

1.4.4脑组织钙含量的测定实验动物用2.5戊二醛0.09 mol/L草酸钾(OPP法)固定液(pH=7.4)灌流固定30 min;取小于1 mm3的脑组织;取材后4℃再用同种固定液固定1 h;用含7.5蔗糖的0.09 mol/L草酸钾(pH=7.4)4℃清洗1 h;用1锇酸2焦锑酸钾(pH=7.4)4℃固定1 h;用去离子水或三蒸水清洗15 min。梯度酒精脱水,环氧丙烷置换,Epon812包埋,铀-铅双染或不经复染,电镜观察。

1.5统计学处理采用SPSS11.5软件包进行统计学分析,两组及多组样本均数比较采用单因素方差分析。方差齐时,两两比较采用LSD法;方差不齐时,两两比较采用Dunnetts’s C法,结果用x±s表示。检验水准α=0.05。