管花肉苁蓉苯乙醇甘的巨噬细胞激活作用及其与当归、黄芪在调节免疫方面的协同作用

骆紫燕 卿德刚2,孙宇2,徐晓琴 张娟2 王子荣

(1.新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐830052；

2.新歳维吾尔自治区中药民族药研究所,新籍乌鲁木齐830002)

摘要：目的：研究管花肉苁蓉笨乙醇昔对巨噬细胞的激活作用，并筛选获得一个复方，研究其对正常小鼠的增强免疫力作用。方法：通过巨噬细胞激活实验■，考察管花肉苁蓉苯乙醇若提取物对巨噬细胞RAW264.7呑噬活性和TNF-a、IL-6等分泌的影响；研究当归、黄芪提取物的配伍对苯乙醇普提取物的巨噬细胞激活作用的影响；据此制备复方片剂，通过ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验、迟发型变态反应试验、抗体生成细胞检测、小鼠碳廓清试验和小鼠腹腔巨噬细胞呑噬鸡红细胞试验，评价其对正常小鼠的免疫调节作用。结果：75、100、125 g/L苯乙醇甘提取物均能提高RAW264.7细胞呑噬活性，以及NO、iNOS、TNF-a、IL-6水平，其中以100 g/L苯乙醇眷提取物效果最佳(P<0.01)；并且，当归、黄芪提取物对苯乙醇谷提取物的巨噬细胞激活功能具有极显著的促进作用(P<0.01)；以此为依据制备的复方片剂,0.4、1.2 g/kg-bw/d组可显著促进淋巴细胞増殖(P<0.05)、1.2 g/kg-bw/d组可显著促进细胞免疫反应(P<0.05),0.4 g/kg-bw/d组可显著促进抗体生成(P<0.05),1.2 g/kg-bw/d组可显著提高小鼠碳廊清能力和巨噬细胞呑噬能力(P<0.05)。结论：苯乙醇若提取物可通过诱导iNOS表达，剌激巨噬细胞合成NO,同时剌激巨噬细胞蜂放TNF-a和IL-6,激活巨噬细胞的免疫调节功能；以其与当归、黄芪提取物制备的复方片剤，可■通过调节细胞免疫、单核-巨噬细胞功能而发挥对正常小鼠的增强免疫力作用，并对体液免疫有积极影响。

关键词：管花肉苁蓉，苯乙醇昔，当归，黄芪，巨噬细胞激活，增强免疫力

列当科植物管花肉苁蓉（Cistanche tubulosa（Schrenk）Wight）是《中国药典》收载的肉苁蓉品种之一⑴，主产于新疆南疆地区，是著名的补益中药，“主五劳七伤，补中，除茎中寒热痛，养五脏，强阴，益精气，多子，妇人症痕，久服轻身”。现代药理学研究表明，肉苁蓉具有抗疲劳片）、抗衰老⑴、保护神经⑴、增强免疫力⑴、润肠通便⑺等多种生物活性，在保健食品开发方面具有独特的优势。

苯乙醇甘和多糖被认为是肉苁蓉中的主要活性成分，其中，多糖的调节免疫活性已得到较多研究证实，它可通过免疫球蛋白受体Fc-y依赖的吞噬作用、TNF-a NF-kB通路、糖酵解/糖原异生以及三按酸循环和呼吸电子运输等实现对巨噬细胞RAW264.7的激活作用“河，并可能通过促进细胞内钙释放促进小鼠胸腺淋巴细胞的增殖，通过促进IL-2分泌提高正常小鼠的脾指数"°-n）o松果菊昔、毛蕊花糖昔等为代表的苯乙醇甘是肉欢蓉发挥药理活性的核心物质基础，但在调节免疫方面的研究则较少。文献报道，肉苁蓉苯乙醇昔能明显增加小鼠血中M中的吞噬能力及免疫器官的重量"气松果菊甘为主要成分的肉欢蓉提取物可通过免疫调节等作用拮抗结肠炎，毛蕊花糖昔对免疫器官、免疫细胞和免疫因子均有明显的调节作用，对D-氨基半乳糖和脂多糖致肝功能衰竭小鼠的细胞凋亡和炎症反应也都有明显的抑制作用&宀说明肉苁蓉中的苯乙醇昔类同样是很有潜力的免疫调节剂。

本文首先研究了管花肉苁蓉苯乙醇甘对巨噬细胞的激活作用，其次，基于传统中医药理论将其与当归、黄度配伍，通过细胞实验证明3者对巨噬细胞激活的协同作用，并以此为依据制备复方片剤，通过动物实验考察复方片剂对正常小鼠的细胞免疫、体液免疫、单核-巨噬细胞功能的调节作用，以期为管花肉苁蓉苯乙醇昔在调节免疫产品方面的应用提供数据支持。

1材料与方法

1.1材料与仪器

Hank's液、RPMI1640培养液、DMEM培养基、MTT'PBS购自武汉普诺赛生命科技有限公司；DNFB购自吴江市青云精细化工厂；SRBC、豚鼠血清购自广州蕊特生物科技有限公司；ConA、大肠杆歯脂多糖（I-PS）购自美国Sigma公司；NO试剂盒、iNOS试剂盒购自南京建成生物工程研究所；ELISA•试剂盒（Mouse TNF-a、Mouse IL-6）购自武汉艾美捷科技有限公司；巨噬细胞RAW264.7购自中国医学科学院细胞中心；SPF级CI/F1代健康雌性小鼠（生产许可证号SCXK（沪）2013-0016）购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司；管花肉苁蓉购自和田秋永霞管花肉苁蓉有限责任公司；当归、黄芷购自新疆九州通医药有限公司。

JA2OO3电子天平上海上天精密仪器有限公司;JJ-100电子天平美国双杰公司；SG-603生物安全柜美国Baker公司；Varioskan LUX多功能酶标仪Theniio F'isher Scientific公司；QP80二氧化碳培养箱山东博科科学仪器有限公司O

1.2实验方法

1.2.1各提取物及复方片剂的制备管花肉苁蓉苯乙醇昔提取物：管花肉欢蓉以75%乙醇溶液提取2次，浓缩干燥，即得（松果菊昔+毛蕊花糖昔=21.3%,总昔：41%）；当归提取物：当归以水提取2次，浓缩后80%醇沉，浓缩干燥，即得（阿魏酸：0.3%）；黄茂提取物：黄茂以水提取2次，浓缩后70%醇沉，干燥沉淀，即得（多糖：32.3%）。

复方片剂：管花肉駅蓉苯乙醇首提取物、当归提取物、黄芷提取物按15：18：12的比例，辅以10%微晶纤维素、9%按甲基淀粉钠、1%硬脂酸镁混合均匀，湿法制粒、压片（0.6 g/片），即得。

1.2.2苯乙醇甘提取物的巨噬细胞激活作用

1.2.2.1对KAW264.7细胞吞噬活性的影响取对数生长期RAW264.7细胞，胰酶消化后调整细胞数至5 x 106个/mL,接种于48孔板（100 jxL/JL）,37,5%CO,条件下培养，待细胞贴壁后，PBS清洗。分別加入DMEM培养基（空白对照组）、LPS（20 mg/L）和样品（苯乙醇昔提取物25、50、75、100、125 g/L）培养24 h,弃上清，加0.075%中性红溶液（100|xL/孔），继续培养1 h,弃上清，PBS清洗2~3遍，加细胞裂解液(100孔)，4龙下放置2 h,酶标仪测定吸光度(540 nm),i|-算相对细胞吞噬活性。相对细胞吞噬活性(%)=处理组吸光度/空白对照组吸光度x 100。

1.2.2.2对RAW264.7细胞NO、iN()S、TNF-a、IL-6的影响按上述方法培养RAW264.7细胞，分别加入DMEM培弄基(空白对照组)、LPS(20 mg/L)和样品(苯乙醇昔提取物25、50、75、100、125 g/L)培养24 h,收集上清液，根据试剂盒说明测定NO、iNOS,Elisa法测定TNF-a、IL-6含量。

1.2.3苯乙醇甘提取物及其与当归和黄茂提取物的组合物对巨噬细胞激活的作用比较

1.2.3.1对RAW264.7细胞吞噬活性的影响以苯乙醇首提取物和当归提取物按15：18的比例混合得到组合物B’以苯乙醇甘提取物、当归提取物和黄芷提取物以15：18：12的比例混合得到组合物C(组合物配比依据《中国药典》中各药材的推荐服用量和各提取物的得率折算)。参照*,1-2.2.1"方法，对比苯乙醇昔提取物(A)、组合物B和C(50,75 g/L)对RAW264.7细胞吞噬活性的影响。

L2.3.2对KAW264.7细胞NO释放量的影响参照“1.222”方法，对比苯乙醇昔提取物(A)、组合物B和C(50、75 g/L)对RAW264.7细胞产生NO的影响。

1.2.4复方片剂对正常小鼠的免疫力的影响参考文献［15］的操作研究复方片剂对正常小鼠淋巴细胞等的影响。

1.2.4.1分组及处理SPF级CI/F1代健康雌性小鼠200只，体重19.0-21.7 g,随机分五大组，每大组40只，1组进行ConA诱导的小鼠牌淋巴细胞转化试验,n组进行耳肿胀试验，hi组进行抗体生成细胞检测，IV组进行小鼠碳廊清试验，v组进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。每大组分别设复方片剂低、中、高剂飛组0.2、0.4、1.2 g/kg•bw/d(分别相当于受试样品人体推荐摄入量:的5倍、10倍、30倍;折算人体推荐摄入量，各药材服用量:均小于《中国药典》规定的用药量)和空白对照组，泄胃体积0.1 inL/10 g•bw,空白对照组给予等体积蒸简水，1次/d,连续灌胃30 do

1.2.4.2ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验灌胃30 d后，处死小鼠，无菌取脾，制细胞悬液，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为3 x 1()'个/ml.。将细胞悬液分两孔加入24孔培弄板，每孔1 inL.—孔加75 p.L ConA液(100|xg/mL),另一孔作对照，置37龙、5%CO］培养箱中培养72 ho培养结束后，用酶标仪按MTI'法在570 nm测定OD值。淋巴细胞增殖能力=加ConA孔的OD值-不加ConA孔的OD值

1.2.4.3迟发型变态反应灌胃30 d后，每鼠腹部剃毛(3 cm x3 cm),以10 ing/mL DNFB溶液50 p.L均匀涂抹致敏。5 d后以10 mg/nil.DNFB溶液10 pX均匀涂抹于小鼠右耳(两面)攻击，攻击24 h后处死小鼠，分别以打孔器取左右耳片(d=8 mm),称重。耳重差(mg)=右耳重(mg)-左耳重(mg)。

1.2.4.4抗体生成细胞检测泄胃30d后，每鼠腹腔注射0.2 niL 2%(v/v)SRBC悬液免疫,4 d后处死小鼠，取脾，制细胞悬液，按Jerne改tl玻片法检测溶血空斑数。溶血空斑数=溶血空斑计数X32O。

1.2.4.5小鼠碳廓清试验灌胃30 d后，每鼠尾静脉注入4倍稀释的印度墨汁(0.1 mL/10 g-bw)，注入后2 min及10 min时分另IJ从眼内眦靜脉丛取血20 p.L,加入2 ml.0.1%Na2CO,溶液中，用酶标仪在600 nm处测OD值，并取胸腺、肝、脾称重，计算胸腺/体比、脾/体比和吞噬指数a。K=(IgODl-lgOD2)/(t2-tl),a=体重/(肝重+脾重)xK,z,o

1.2.4.6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验试验前4 d给每鼠腹腔注射2%压积羊血红细胞0.2 mL。处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank's液(4 mL/只)，轻轻按揉腹部20次，然后将腹壁剪开一个小口，吸取腹腔洗液2 inL于试管内。吸取0.5 mL腹腔洗液加入盛有0.5 inL 1%鸡血红细胞悬液的试管内，混匀。取混合液加入玻片琼脂圈内，37 P孵育15-20 mino孵育后将未贴壁细胞洗掉，固定，Giemsa染色，洗片，晾干，显微镜计数，计算吞噬率和吞噬指数。吞噬百分率(%)=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的吞噬细胞数x 10(),吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数。

1.3数据分析

数据均以X士S表示，用SPSS软件对各实验原始数据进行方差分析。以P<0.01作为非极显著性差异,P<0.05作为显著性差异。

2结果与分析

2.1苯乙醇昔提取物的巨噬细胞激活作用

2.1.1苯乙醇甘提取物对RAW264.7细胞吞噬活性的影响本实验首先研究了25、50、75、100、125 g/L苯乙醇甘提取物对RAW264.7细胞吞噬活性的影响。结果表明，LPS组细胞吞噬活性相比空白对照组具有极显著差异(P<0.01),75J00 g/L组样品可极显著提高细胞吞噬活性(P<0.01),125 g/L组可显著增强细胞吞噬活性(P<0.05),提示苯乙醇昔提取物具有激活巨噬细胞的作用，见图1