肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体对ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的肝星状细胞增殖的影响及作用机制研究

马晓婷，张石蕾，王志强，陈文龙，由淑萍，刘涛△

（新疆医科大学公共卫生学院，乌鲁木齐８３００１１）

摘要］目的探讨肉苁蓉苯乙醇总苷（ＣＰｈＧｓ）脂质体对重组大鼠血小板衍生生长因子－ＢＢ（ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ）诱导的大鼠肝星状细胞（ＨＳＣ）增殖作用的影响及其抗肝纤维化的相关分子机制。方法取生长状态良好的对数生长期ＨＳＣ用于实验，置于ＣＰｈＧｓ脂质体浓度为１１７．７９、５８．９０、２９．４５、１４．７２、７．３６、３．６８、１．８４、０．９２和０．４６ｍｇ／Ｌ的完全培养液，求出半数抑制浓度（ＩＣ５０）；ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ刺激后，采用四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）法测定２９．４５、１４．７２、７．３６ｍｇ／ＬＣＰｈＧｓ脂质体对ＨＳＣ增殖的影响；采用实时荧光定量聚合酶链反应（ｑＲＴ－ＰＣＲ）检测α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ）、Ⅰ型胶原、ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ的表达水平；采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ＣＰｈＧｓ脂质体对ｐ－ｐ３８蛋白表达的影响。结果（１）对细胞增殖的影响：对不同时间点结果分析显示，与Ｎｏｒｍａｌ组比较，细胞培养４８ｈ时，ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组ＨＳＣ细胞明显增多；ＣＰｈＧｓ脂质体各剂量组抑制ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ增殖作用，培养４８ｈ效率最高；对不同浓度结果分析显示，与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组比较，不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组均可抑制ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ－Ｔ６的增殖。（２）ｑＲＴ－ＰＣＲ结果：ＣＰｈＧｓ脂质体各剂量组间比较，随ＣＰｈＧｓ脂质体药物浓度增大，α－ＳＭＡ、Ⅰ型胶原和ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ水平显著下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），其中以ＣＰｈＧｓ脂质体２９．４５ｍｇ／Ｌ组抑制效果最明显。（３）Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析结果：ｐ－ｐ３８蛋白的表达水平在ＣＰｈＧｓ脂质体不同浓度组表达均下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；ＣＰｈＧｓ脂质体各剂量组间比较，ｐ－Ｐ３８蛋白随ＣＰｈＧｓ脂质体干预剂量增大，表达水平显著下降（Ｐ＜０．０５）。结论ＣＰｈＧｓ脂质体能抑制ｒｒＰ－ＤＧＦ－ＢＢ诱导的大鼠ＨＳＣ增殖，从而起到抗肝纤维化的作用。

［关键词］肝星状细胞；肝纤维化；重组大鼠血小板衍生生长因子－ＢＢ；肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体

［中图法分类号］Ｒ３３２［文献标识码］Ａ［文章编号］１６７１－８３４８（２０１９）１０－１６３０－０５

肝纤维化（ｈｅｐａｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓ，ＨＦ）是一种常见的慢性肝损伤过程，许多与肝损伤相关的因素都可以导致ＨＦ［１］。在ＨＦ病理过程中常出现以下症状：肝细胞坏死、结缔组织异常增生、肝循环紊乱等，最终导致肝硬化继而引发肝衰竭［２］。之前的研究报道指出，ＨＦ是一种可逆的病理现象，早期预防或治疗ＨＦ对慢性肝病的治疗有重要意义［３］。目前研究的重点是寻找疗效确切、不良反应小的药物，以延缓、抑制甚至逆转ＨＦ的进程［４］。一些临床实践和试验研究证明，中医药通过多成分、多路径、多层次、多目标的综合药理作用能减缓ＨＦ的进程［５－７］。肉苁蓉是名贵的补益类中药，分布于中国北部的干旱地区和沙漠地区［８］。脂质体作为载体在临床应用中具有安全性好、生物相容性好、载药及靶向效果明确的优点，也是最早用于靶向给药的载体［９］。本研究旨在探讨肉苁蓉苯乙醇总苷（ＣＰｈＧｓ）脂质体对重组大鼠血小板衍生生长因子（ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ）诱导的肝星状细胞（ｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌ，ＨＳＣ）增殖的作用，为肝纤维化的治疗提供依据。

１材料与方法

１．１材料用薄膜分散二次包封法制备ｐＰＢ修饰的肉苁蓉总苷靶向脂质体，其粒径为２１２．７ｎｍ，电位３５～５０ｍＶ，包封率（３８．４６±７．８５）％，由本实验室保存。ＨＳＣ（中乔新舟），胎牛血清（美国Ｇｉｂｃｏ公司），青霉素（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司），链霉素（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司），ＤＭＥＭ高糖培养基（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司），四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ，美国Ｓｉｇｍａ公司），二甲基亚砜（ＤＭＳＯ，美国Ｓｉｇｍａ公司），磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，ＢＩ公司），０．２５％胰酶（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司），ＴＲＩｚｏｌＲｅａ－ｇｅｎｔ（赛默飞公司），ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（赛默飞公司），ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭⅡ（ＴａＫａＲａ公司），ＰＩＰＡ裂解液（赛默飞公司），蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ，博士德生物），蛋白定量试剂盒（ＢｉｏＭＩＧＡ公司），十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）凝胶制备试剂盒（北京索莱宝公司），５×Ｔｒｉｓ－甘氨酸电泳缓冲液（北京索莱宝公司），１０×电转液（北京索莱宝公司），１０×ＴＢＳＴ（北京索莱宝公司），无水乙醇（天津大茂化学试剂厂），异丙醇（天津富宇精细化工有限公司），氯仿（天津大茂化学试剂厂），甲醇（天津市大茂化学试剂厂），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔ＩｇＧ（中杉金桥），ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ（Ｒ＆Ｄ公司），４×蛋白上样缓冲液（北京索莱宝公司），兔抗β－ａｃｔｉｎ多克隆抗体（北京博奥森生物科技有限公司），兔抗ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）多克隆抗体（北京博奥森生物科技有限公司），兔抗ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ多克隆抗体（北京博奥森生物科技有限公司）。

１．２方法

１．２．１细胞培养与传代大鼠ＨＳＣ在含有１００Ｕ／ｍＬ青霉素、１００ｍｇ／Ｌ链霉素和１０％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ细胞培养液，于３７℃、５％ＣＯ２培养箱中培养。细胞隔日换液，待生长融合至８０％～９０％时，使用０．２５％胰蛋白酶消化收集细胞，按１∶２进行传代培养，实验均采用对数生长期细胞。

１．２．２抑制率为５０％时的药物浓度计算实验设９个ＣＰｈＧｓ脂质体系列浓度组和１个空白对照组，共１０组，每组３个复孔。ＣＰｈＧｓ脂质体系列浓度组剂量分别为１１７．７９、５８．９０、２９．４５、１４．７２、７．３６、３．６８、１．８４、０．９２和０．４６ｍｇ／Ｌ。将处于对数生长期，浓度为５×１０４／ｍＬ的ＨＳＣ－Ｔ６细胞悬液接种于９６孔板，每孔添加量为１００μＬ，每组设３个复孔，于３７℃、５％ＣＯ２培养箱中培养２４ｈ后，观察细胞生长状态，若贴壁则弃上清液，根据分组设计分别更换含１１７．７９、５８．９０、２９．４５、１４．７２、７．３６、３．６８、１．８４、０．９２和０．４６ｍｇ／ＬＣＰｈＧｓ脂质体的完全培养液和空白完全培养液。加药后轻晃混匀，放至培养箱继续培养４８ｈ，镜下观察细胞状态，拿至工作台，避光，每孔加浓度为５ｍｇ／ｍＬ的ＭＴＴ２０μＬ，放至培养箱，４ｈ后，吸去孔里的液体，每孔加入ＤＭＳＯ１５０μＬ，于摇床轻晃１０ｍｉｎ，用酶标仪于４９２ｎｍ波长测定，记录吸光度（Ａ）值。计算各复孔Ａ值能平均值，计算抑制率，以此找寻ＣｐｈＧｓ脂质体的最佳作用浓度。抑制率（％）＝（１－各浓度的平均Ａ值）／空白组平均Ａ值×１００％）；以ＣＰｈＧｓ脂质体作用浓度为横轴，细胞生长抑制率为纵轴，绘制ＣＰｈＧｓ脂质体作用于ＨＳＣ－Ｔ６的量效反应曲线，采用Ｐｒｏｂｉｔ分析计算５０％存活率的ＣＰｈＧｓ脂质体浓度，即为半数抑制浓度（ＩＣ５０）。１．２．３细胞分组（１）Ｎｏｒｍａｌ组；（２）ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组；（３）ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ＋２９．４５ｍｇ／ＬＣＰｈＧｓ脂质体组；（４）ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ＋１４．７２ｍｇ／ＬＣＰｈＧｓ脂质体组；（５）ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ＋７．３６ｍｇ／ＬＣＰｈＧｓ脂质体组。各组细胞均培养２４ｈ后进行后续实验。

１．２．４不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体对ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ增殖的影响大鼠ＨＳＣ以１×１０５／ｍＬ密度接种至９６孔板，待细胞贴壁后进行分组干预，每组设３个复孔。分别培养２４、４８和７２ｈ，每孔加入２０μＬ的ＭＴＴ溶液，培养箱内３７℃培养４ｈ后，弃去ＭＴＴ溶液，再向各孔内加入１５０μＬ的ＤＭＳＯ，置于摇床室温摇动１０ｍｉｎ，待结晶充分溶解后，于酶标仪４９２ｎｍ波长处测定Ａ值。抑制率＝［（模型组－空白组）－（用药组－空白组）］／（模型组－空白组）×１００％。

１．２．５实时荧光定量聚合酶链反应（ｑＲＴ－ＰＣＲ）检测α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ）、Ⅰ型胶原和ＡＴＦ－２的ｍＲＮＡ的表达Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒提取大鼠ＨＳＣ总ＲＮＡ，经纯度及完整性鉴定后反转录反应生成ｃＤ－ＮＡ。按照ｑＲＴ－ＰＣＲ试剂盒说明书建立ｑＲＴ－ＰＣＲ反应体系，使用ｑＲＴ－ＰＣＲ检测仪进行检测。ｑＲＴ－ＰＣＲ热循环参数：９５℃预变性３０ｓ，９５℃变性５ｓ，６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸４５ｓ，共４０个循环。结果分析以β－ａｃｔｉｎ为内参基因，确定每个样品、每个基因扩增的循环阈值（ＣＴ），按照２－△△ＣＴ计算目的基因的相对表达水平，所用引物序列见表１。

ＡＴＦ－２参与多条信号通路的传导，同时在肝组织表达的ＡＴＦ－２的碱基在ｐ３８磷酸化后出现转录活性和ＤＮＡ结合的增加。本研究探讨不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体对ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ增殖的影响。ｑＲＴ－ＰＣＲ扩增检测α－ＳＭＡ、Ⅰ型胶原、ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ结果提示，与Ｎｏｒｍａｌ组相比，ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组α－ＳＭＡ、Ⅰ型胶原、ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ表达明显增高；与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组相比，不同浓度的ＣＰｈＧｓ脂质体均可不同程度下调α－ＳＭＡ、Ⅰ型胶原、ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ表达，其中２９．４５ｍｇ／ＬＣＰｈＧｓ脂质体组下调作用最明显，α－ＳＭＡ，Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ与Ｎｏｒｍａｌ组比较，差异无统计学差异，作者认为产生这种现象的原因在于浓度越高，其对ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ引起的ＨＳＣ增殖的抑制效果越明显，越趋近于正常。作者认为ＣＰｈＧｓ脂质体能有效抑制ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ刺激的ＨＳＣ中Ⅰ型胶原和ＡＴＦ－２ｍＲ－ＮＡ表达、下调α－ＳＭＡｍＲＮＡ表达，进而减少ＥＣＭ合成与分泌，阻止ＨＦ的形成。

此外，ＭＡＰＫ信号转导途径及其子系统ｐ３８通路参与ＨＳＣ的活化，因而可能成为治疗ＨＦ的靶点。ｐ３８ＭＡＰＫ是ＭＡＰＫ家族成员之一，ｐ３８是由各种刺激引起的许多细胞的传感器，且在调节棕色脂肪细胞、肌肉细胞和肝细胞的能量平衡过程中起着重要的作用，ｐ３８ＭＡＰＫ也被认为在调节炎性因子方面扮演重要角色。因此，ｐ３８ＭＡＰＫ激活可能在ＨＳＣ损伤与炎症过程中发挥作用。研究证明ＰＤＧＦ－ＢＢ可通过ＭＡＰＫ信号通路诱导ＨＳＣ细胞活化与增殖［２１］。栀子苷可抑制ｐ－ｐ３８蛋白的表达从而起到抑制ＨＦ的作用［２２］。本研究结果显示，与Ｎｏｒｍａｌ组比较，ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组ｐ－ｐ３８的蛋白表达水平明显增高，表明ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ可通过影响ＭＡＰＫ信号而使ＨＳＣ活化增殖。不同浓度的ＣＰｈＧｓ脂质体组，ｐ－ｐ３８的蛋白表达水平随着药物浓度的升高逐渐降低，且将不同浓度的ＣＰｈＧｓ脂质体组ｐ－ｐ３８的蛋白表达水平与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组比较，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。由此可见，ＣＰｈＧｓ脂质体可在一定程度上抑制ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ增殖与活化，从而抑制ＨＦ的形成。当前，对ＨＦ的了解较少，全新的方法及技术手段将会对ＨＦ进行深入研究，从而对干预、早期诊断和治疗ＨＦ提供全新的治疗策略。

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