肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体对大鼠T6肝星状细胞凋亡的影响及作用机制研究

马晓婷1，张石蕾1，由淑萍2，赵军3，刘涛1

(新疆医科大学1．公共卫生学院、2．护理学院，新疆乌鲁木齐830011;

3．新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆乌鲁木齐830004)

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2018．10．024 文献标志码:A文章编号:1001－1978(2018)10－1450－06 中国图书分类号:Ｒ-332;Ｒ284.1;Ｒ322.47;Ｒ329.24;Ｒ329.25;Ｒ575.202.2

摘要:目的探讨肉苁蓉苯乙醇总苷(phenylethanol glyco-sides from cistanche tubuiosa，CPhGs)脂质体对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)凋亡的影响及其抗肝纤维化的相关分子机制。方法培养HSC-T6，取生长状态良好的对数生长期细胞用于实验，采用重组大鼠血小板衍生生长因子BB(rrPDGF-BB)刺激HSC-T6，构建体外肝纤维化模型。MTT法测定CPhGs脂质体(29.45、14.72、7.36 mg·L－1)对HSC-T6增殖的影响;AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂标记后，流式细胞仪检测CPhGs脂质体不同浓度组的细胞凋亡率;实时荧光定量PCＲ(qＲT-PCＲ)检测α-SMA、Collagen I、CollagenⅢmＲNA的表达水平;Western blot法检测CPhGs脂质体对p-JNK蛋白表达的影响。结果不同浓度CPhGs脂质体均可抑制rrPDGF-BB诱导的HSC-T6的增殖;CPhGs脂质体(29.45、14.72 mg·L－1)组凋亡率明显升高;qＲT-PCＲ结果显示，CPhGs脂质体不同浓度组均可下调α-SMA、Collagen I、CollagenⅢmＲNA水平的表达，并能降低p-JNK蛋白的表达。结论CPhGs脂质体能抑制大鼠HSC-T6的增殖并诱导其凋亡，其作用可能与抗肝纤维化有关。

关键词:肉苁蓉;苯乙醇总苷;肝星状细胞;细胞凋亡;脂质体;肝纤维化

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是一种慢性的瘢痕形成与修复过程，是发病率和死亡率都很高的世界医学难题。HF的特点是细胞外基质过度沉积，晚期HF可诊断为肝硬化，并最终可能发展为肝衰竭，甚至肝细胞癌［1］。目前公认肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化是HF进展过程中的关键事件［2］。在HF进程中，HSC激活成肌成纤维细胞是瘢痕形成的关键环节［3－4］。中医具有治疗复杂疾病及相关疾病的功效，肉苁蓉(Cistanche)是著名的名贵补益类中药，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫调节等作用。课题组前期研究证实，肉苁蓉苯乙醇苷类化合物具有良好的保肝护肝作用，且其能引起Fas诱导的HSC凋亡［5］。本研究旨在探讨肉苁蓉苯乙醇总苷(phenylethanol glycosides from cistanche tu-buiosa，CPhGs)脂质体对HSC凋亡的影响及其分子机制，通过靶向载药系统转运药物，来克服一些药物半衰期短、无法到达靶器官，或到达了但无法在其周围形成有效药物浓度等缺点，最大程度发挥药物疗效，达到长效、靶向及减轻药物副作用等目的，期望能寻求更多的可以应用于临床治疗HF的靶向药物治疗途径，为HF的治疗提供理论基础。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1细胞株大鼠HSC-T6细胞株，购自上海中乔新舟生物科技有限公司，货号:ZQ0780。

1．1．2药物与试剂用薄膜分散二次包封法制备pPB修饰的肉苁蓉总苷靶向脂质体，其粒径为212.7 nm，电位35～50 mV，包封率(38.46±

7.85)%，由本实验室保存。胎牛血清(美国Gibco公司);DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司);MTT(美国Sigma公司);Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司);TＲIzolＲeagent(Life technologies);ＲevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、ＲIPA裂解液(赛默飞公司);SYBＲPremix Ex TaqTMⅡ(TaKaＲa公司);蛋白定量试剂盒(Biomiga公司);重组大鼠血小板衍生生长因子BB(recombi-nant rat platelet-derived growth factor BB，rrPDGF-BB)(Ｒ＆D公司);抗β-actin、JNK、p-JNK多克隆抗体(北京博奥森生物科技有限公司)。

1．1．3仪器超净工作台、全波长自动酶联免疫反应检验测试仪(美国Thermo Scientific公司);CK-40型荧光倒置显微镜(日本Olympus公司);低温离心机( 美国Sigma 公司) ; Western blot 电泳装置及转膜装置( 美国 Bio-Ｒad 公司) ; QuantStudio 6 Flex 型实时荧光定量 PCＲ 仪( 美国 ABI 公司) 。

JNK已显示对不同细胞类型的细胞增殖有积极的调节作用，JNK通过负性调节作用来抑制静止HSC的活化，从而阻止HSC的增殖，刺激MAPK信号通路，从而使其下游通路阻断，起到预防HF的作用。本研究结果显示，与Normal组比较，rrPDGF-BB组p-JNK的蛋白表达量明显增高，表明rrPDGF-BB0)可通过影响MAPK信号，使HSC活化增殖。不同浓度的CPhGs脂质体组，p-JNK的蛋白表达量随着药物浓度的升高逐渐降低，且不同浓度的CPhGs脂质体组p-JNK的蛋白表达量与rrPDGF-BB组比较，差异均有统计学意义。由此可见，CPhGs脂质体可在一定程度上抑制rrPDGF-BB诱导的HSC增殖与活化，促进HSC凋亡，从而抑制HF的发生、发展。本研究结果为后续实验进一步研究CPhGs脂质体抗HF作用机制提供了扎实的理论基础。期望能够寻求更多抗HF的靶向给药途径，给HF患者带来福音。

参考文献:

［1］Huang Y，Deng X，Liang J，et al．Modulation of hepatic stellate cells and reversibility of hepatic fibrosis［J］．Exp CellＲes，2017，352(2):420－6．

［2］Zhao G N，Jiang D S，Li H，et al．Interferon regulatory factors:at the crossroads of immunity，metabolism，and disease．［J］．Bio-chim Biophys Acta，2015，1852(2):365－78．

［3］Mederacke I，Hsu C C，Troeger J S，et al．Fate tracing reveals hepatic stellate cells as dominant contributors to liver fibrosis inde-pendent of its aetiology［J］．Nat Commun，2013，4(7):2823．

［4］Iwaisako K，Jiang C，Zhang M，et al．Origin of myofibroblasts in the fibrotic liver in mice［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2014，111(32):3297－305．

［5］Liu T，Zhao J，Ma L，et al．Hepatoprotective effects of total triter-penoids and total flavonoids from Vitis vinifera L against immuno-logical liver injury in mice［J］．Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012(1):969－86．

［6］Yin C，Evason K J，Asahina K，et al．Hepatic stellate cells in liv-er development，regeneration，and cancer［J］．J Clin Invest，2013，123(5):1902－10．

［7］Puche J E，Lee Y A，Jiao J，et al．A novel murine model to de-plete hepatic stellate cells uncovers their role in amplifying liver damage in mice［J］．Hepatology，2013，57(1):339－50．

［8］宋阳，詹磊，黄成，等．瞬时感受器电位离子通道香草素受体亚家族4调控肝星状细胞活化增殖作用研究［J］．中国药理学通报，2016，32(5):681－7．

［8］Song Y，Zhan L，Huang C，et al．Ｒegulatory effects of TＲPV4 on liver fibrosis of rats［J］．Chin Pharmacol Bull，2016，32(5):681－7．

［9］由淑萍，赵军，马龙，等．肉苁蓉苯乙醇总苷对血小板衍生生长因子诱导的肝星状细胞增殖的影响及机制［J］．中国药理学通报，2016，32(9):1231－5．