肉苁蓉成分cam pneosideⅡ对神经毒素M PP+诱发细胞凋亡的保护作用

蒲小平1,李晓蓉1,李慧浓1,屠鹏飞2,宋志宏2,李长龄1

(北京大学药学院1.分子与细胞药理学系,2.天然药物学系,北京100083)

[关键词]1-甲基-4-苯基吡啶离子;campneosideⅡ;肉苁蓉/药理学;神经毒素类;细胞凋亡/药物作用

[摘要]目的:建立1-甲基-4苯基吡啶离子(1-methy-l 4-phenylpyridinium ion,M P P+)诱导的大鼠小脑颗粒细胞凋亡模型,探讨肉苁蓉成分是否对M P P+诱导的大鼠小脑颗粒细胞凋亡有保护作用。方法:用肉苁蓉成分预先孵育大鼠小脑颗粒细胞,经M P P+处理这些细胞后,用甲基绿-派诺宁染色、DNA凝胶电泳、流式细胞术检测。结果:浓度为50μmol·L-1M P P+使小脑颗粒细胞发生典型的凋亡,25 mg·L-1campneosideⅡ具有抗凋亡作用。结论:以M PP+为诱导剂建立的大鼠小脑颗粒细胞凋亡模型,可用于研究与帕金森病(P arkinson's disease,PD)有关的细胞凋亡的调控机制和筛选抗PD药物,中药肉苁蓉成分campneosideⅡ对神经毒素M P P+诱发细胞凋亡具有明显的保护作用。

[中图分类号]R392.55[文献标识码]A[文章编号]1671-167X(2001)03-0217-04

用神经毒素1-甲基4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-pheny l-1,2,3,6-tet rahydropy ridiniumion,MPTP+)制作的帕金森病(Parkinson's disease,PD)样动物模型常用于抗PD药物的研究和开发[1]。M PTP在脑中被单胺氧化酶氧化成活性代谢衍生物1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-met hyl-4-phenylpy ridinium ion,M PP+),M PP+可以导致多巴胺能神经细胞损伤。近年研究表明,PD的病理过程中存在细胞凋亡机制[2]。为建立与PD有关的神经细胞凋亡模型,筛选中药抗凋亡剂,本研究以M PP+为凋亡诱导剂,用甲基绿-派诺宁染色,DNA凝胶电泳,流式细胞术检测MPP+诱发的大鼠小脑颗粒细胞。并对临床常用的补肾中药肉苁蓉成分campneosideⅡ(图1)等进行了筛选。

1材料与方法

1.1动物

7～8 d Wistar大鼠,北京大学医学部实验动物科学部提供。

1.2试剂

M EM培养基(G ibco),蛋白酶K(Merck),多聚赖氨酸(相对分子质量大于30×103,Sigma),碘化丙啶(propidium iodide,PI)及M PP+(Sigma),其余试剂为国产分析纯。肉苁蓉成分campneosideⅠ,campneosideⅡ,acteoside由本院天然药物学系宋志宏博士提供。

1.3仪器

CO2培养箱(美国Precision Scientific),JJT-900型超净工作台(北京半导体设备一厂),倒置显微镜(重庆光学仪器厂),高速低温离心机(美国So rvall),紫外荧光观察照像仪、DNA电泳仪(北京六一仪器厂)。FACS Calibur流式细胞仪(USA),凋亡分析采用ModFit LT软件。

1.4方法

1.4.1小脑颗粒细胞的培养与药物处理[3,4]7～8 d Wistar大鼠,常规消毒后,无菌分离小脑颗酮脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光镜下做凋亡细胞的形态学观察。

凋亡细胞DNA电泳[7,8]:小脑颗粒细胞培养方法同上。加50μmol·L-1 M PP+溶液后,分别于24、48、72 h收集模型组、药物组和对照组细胞3×109 cells·L-1,预冷PBS洗2次,用适量细胞裂解液悬浮细胞,加蛋白酶K使其终质量浓度为200 mg·L-1,

37℃水浴过夜,加入等体积饱和酚溶液,抽提2次,加入2倍体积无水乙醇混匀,再加入1/10倍体积3 mol·L-1醋酸钠溶液混合,-20℃放置2 h,105×g离心10 min沉淀DNA,弃无水乙醇后用70(体积分数)乙醇漂洗两次,沉淀溶于适量TE缓冲液中,再加入25μl RNA酶(10 g·L-1)放置37℃30 min,加热68℃10 min,以除去RNA。置4℃冰箱保存备用,提取产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳(60 V,1.5 h),以检测M PP诱导细胞凋亡中所产生的DNA梯状裂解。

流式细胞仪分析:用流式细胞仪定量检测细胞凋亡的百分率[9]。收集对照组、模型组、药物组不同时间的细胞1×109 cell·L-1,用PBS离心(500×g,5 min)洗涤2次弃上清,加入70(体积比)乙醇1.0 ml。500×g离心5 min洗涤制成单细胞悬液,每毫升细胞悬液加PI(1 g·L-1)100μl染色,暗室放置30 min后,用流式细胞仪检测,实验数据经凋亡分析软件ModFit LT处理。

我们用以上方法观察到campneosideⅡ具有拮抗MPP+诱导的小脑颗粒细胞凋亡的作用。虽然肉苁蓉成分campneosideⅠ、campneosideⅡ和acteo-side都是苯乙醇甙类化合物,结构相似。但在LDH漏出率的测定中,campneosideⅡ的作用较强,而campneosideⅠ和acteoside的作用较弱,这可能与这些化合物对细胞膜通透性的差异有关。有文献[11]报道acteoside对细胞膜的通透性较弱。

肉苁蓉为历代补肾壮阳处方中使用频度最高的补益药物之一,具有明显的抗疲劳、抗老年痴呆、抗衰老等作用。陈建宗等[12]用含有肉苁蓉的平颤一号口服液治疗PD,获良好效果,我们研究了肉苁蓉成分campneosideⅡ抗PD细胞模型的凋亡作用,为抗凋亡剂用于预防和延缓PD等中枢神经退行性疾病提供实验依据,但其抗凋亡机制有待进一步研究。

参考文献

1Garcia E,Rios C,Sotelo J.V entricular injection of nerve growth factor increases dopamine content in the st riata of M PT P-t reated mice[J].N eurochem Res,1992,17:979-982

2Bruno D,Ann M M,Richard JY.A poptosis and DNA degradation induced by 1-methyl-4-phenylpy ridinium in neurons[J].Biochem Biophys Res Commou,1991,181:1442-1448

3Levi G,A loisi F,Ciotti M T,et al.A utoradiographic locali zation and depolarization induced release of acidic amino acids in diff erent i-ating cerebellar granule cell cultures[J].Brain Res,1984,290:77-86

4鄂征.基本培养技术,各别细胞和组织的培养.见:鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术[M].第2版.北京:北京出版社,

5杜卓民主编.实用组织学技术[M].北京:人民卫生出版社,1982.282-284

6M offi tt P.Amethyl green-pironi n technique for demonstrating cell death in the murine tumou r S 180[J].Cell Biol,1994,18:677-681

7Santosh R,D'M ello,Gall C,et a l.Induction of apoptosis in cere-bellar granule neu rons by low potassium:Inhibit ion of death by in-sulin-like grow th factorⅠand cAM P[J].Proc Natl Acad Sci,USA,1993,90:10989-10993

8李尹雄,沈羽飞.核酸的分离与纯化.见:卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术[M].北京:高等教育出版社,1993.95-134

9Nicoletti I,M igliorati G,Pagliacci M C,et al.A rapid and simple method for measu ring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry[J].J Immunol M ethods,1991,139:271-297

10M arini AM,Schwartz JP,Kopin IJ.T he neurotoxicity of 1-methyl-4-phenylpy ridinium i n-cult ured cerebellar granule cells[J].J Neurosci,1989,(9):3665-3672

11Xiong QB,Hase K,Tezuka Y,et al.T he acteoside inhibits apop-tosis in D-galactosamine and lipopolysaccharide-induced liver injury[J].Lif e Sci,1999,65,(4):421-430

12陈建宗,江文,吴宝仁,等.平颤1号口服液治疗帕金森病40例[J].安徽中医学院学报,1999,18(2):9-11