肉苁蓉标准汤剂质量研究

梁渐崧1，2，4，潘英杰2，4，陈紫颖2，4，张英1，3，吴孟华1，3，曹晖1，3，马志国1，3*

(1.暨南大学药学院，广东广州510632;2.广东一方制药有限公司，广东佛山528244;3.暨南大学岭南传统中药研究中心，广东广州510632;4.广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东佛山528244)

摘要:目的制备肉苁蓉标准汤剂并为其质量控制提供可靠方法。方法依照标准汤剂的制备要求，制备14批肉苁蓉标准汤剂，采用HPLC法测定标准汤剂中松果菊苷和毛蕊花糖苷含量，计算其转移率，测定汤剂的出膏率和pH值，并建立肉苁蓉标准汤剂的UPLC指纹图谱。结果14批肉苁蓉标准汤剂中松果菊苷和毛蕊花糖苷平均转移率分别是22.99%、17.09%，出膏率范围为25.1%～56.6%，pH值范围为4.30～5.15。指纹图谱中有6个共有峰，指认了其中的1号峰为松果菊苷、3号峰为管花苷A、4号峰为毛蕊花糖苷、5号峰为异毛蕊花糖苷。对14批肉苁蓉标准汤剂进行相似度评价，其相似度范围在0.789～0.999之间。结论肉苁蓉标准汤剂制备规范，整体均一性良好，质量可控，测定方法精密度、稳定性和重复性良好，指纹图谱相似度高，可为肉苁蓉标准汤剂的质量控制提供参考。

关键词:肉苁蓉;标准汤剂;松果菊苷;毛蕊花糖苷;指纹图谱;质量评价

中图分类号:R284文献标识码:A文章编号:1006-3765(2021)-04-0027-05

肉苁蓉为列当科肉苁蓉属植物肉苁蓉Cistanche desertico-la Y.C.Ma或管花肉苁蓉Cistanche tubulosa(Schenk)R.Wight的干燥带鳞叶的肉质茎〔1〕，具有补肾阳，益精血，润肠通便的作用〔1〕，广泛应用于阳痿，不孕，腰膝酸软，筋骨无力，肠燥便秘等症〔2〕。主要含有苯乙醇苷类、苯甲醇苷类、环烯醚萜及其苷类、木质素及其苷类、其他类化合物等〔3〕。其中，苯乙醇苷类化合物被认为是肉苁蓉中的主要有效成分〔4〕。

中药饮片标准汤剂(即标准煎液)是以中医理论为指导、临床应用为基础，参考现代提取方法，经标准化工艺制备而成的单味饮片水煎液〔5〕。由于标准汤剂没有辅料干扰，没有经过干燥过程，保持与临床应用传统汤剂的一致，且标准汤剂易于通过饮片或提取液的调配试验各种理想浓度。因此中药饮片标准汤剂，作为经典明方制剂的质量基准和衡量中药配方颗粒的标准参照物，以期实现临床疗效的一致性，是目前保障中药安全、有效、稳定的有效形式。目前，暂无关于肉苁蓉饮片标准汤剂研究的文献报道。本实验对14批肉苁蓉制备相应的标准汤剂，并进行肉苁蓉标准汤剂研究，以期建立肉苁蓉质量标志物的核心标本，为肉苁蓉配方颗粒的开发提供实验依据。

1仪器与材料

1.1仪器及设备Waters e2695高效液相色谱仪(沃特世公司);ME204E万分之一天平(梅特勒-托利多公司);XP26百万分之一天平(梅特勒-托利多公司);Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪(沃特世公司);KQ-500E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试剂与材料松果菊苷对照品(批号:S-003-190403)、管花苷A对照品(批号:G-066-181216)、毛蕊花糖苷对照品(批号:M-011-181106)、异毛蕊花糖苷对照品(批号:Y-073-170325)均购自成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度均大于98.0%。色谱纯甲酸，天津市科密欧化学试剂有限公司;色谱纯甲醇，默克股份有限公司;实验用水为实验室超纯水系统，默克股份有限公司;其它试剂均为分析纯。

本研究共收集市售14批肉苁蓉饮片，经暨南大学马志国教授鉴定为列当科肉苁蓉属植物肉苁蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma或管花肉苁蓉C.tubulosa(Schrenk)Wight的干燥带鳞叶的肉质茎。样品信息(见表1)。

2方法与结果

2.1标准汤剂和供试品溶液制备2.1.1肉苁蓉标准汤剂的制备:根据《医疗机构中药煎药室管理规范》、《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》、《中药饮片标准汤剂》规定，取肉苁蓉饮片100 g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加水9倍，浸泡30 min，武火(500W)加热煮沸后，改文火(200W)保持微沸，继续煎煮60 min，煎液经350目筛网趁热过滤。第二次加水7倍量，武火加热煮沸后，改文火保持微沸，继续煎煮40 min，煎液用350目筛网趁热过滤，合并两次煎液。将煎液转移至2000 mL圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度:60℃;真空度:－0.10 MPa)定容至500 mL，摇匀。

2.1.2肉苁蓉饮片供试品溶液的制备:取肉苁蓉饮片粉末(过四号筛)约1 g，精密称定，置100 mL棕色量瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，摇匀，称定重量，浸泡30 min，超声处理40 min(功率250 W，频率35 kHz)，放冷，再称定重量，加50%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，以0.22μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.3肉苁蓉标准汤剂供试品溶液的制备:取肉苁蓉标准汤剂，摇匀，精密量取5 mL至50 mL量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，以0.22μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.4对照品溶液的制备:取松果菊苷对照品、毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，置10 mL棕色量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成上述2个成分浓度分别为0.0200、0.02100 mg·mL－1的溶液，即得混合对照品溶液。

2.2松果菊苷和毛蕊花糖苷成分的含量测定按照《中国药典》2015年版一部肉苁蓉项下含量测定方法，采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6×150 mm，5μm)，以甲醇为流动相A，以0.1%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱(0～17 min，26.5%A;17～20 min，26.5%→29.5%A;20～27 min，29.5%A);流速1.0 mL·min－1;柱温30℃;检测波长330 nm;理论板数按松果菊苷峰计算应不低于3000。测定肉苁蓉饮片及其标准汤剂中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量，结果(见表2)。

2.3肉苁蓉饮片标准汤剂评价特征参数的测定

2.3.1出膏率:将2.1.1项下制得的肉苁蓉标准汤剂进行摇匀，精密吸取100 mL，置已恒重的蒸发皿(重量为m1)中进行水浴蒸干，蒸干后在105℃的烘箱中干燥3 h，取出后放置于干燥器中冷却干燥30 min，称定重量，记录其重量为m2，药材重量为M，按公式“出膏率=(m2－m1)×500/(100×M)×100%”计算出膏率，每份样品均平行2份后取平均值。结果(见表2)。

2.3.2转移率:根据以上松果菊苷和毛蕊花糖苷成分含量测定结果，按照转移率的公式分别计算松果菊苷和毛蕊花糖苷成分转移率(转移率=肉苁蓉标准汤剂中指标成分质量/饮片中指标成分质量×100%)，每份样品平行2份。结果(见表2)。

2.3.3 pH值:将2.1.1项下制得的肉苁蓉标准汤剂进行摇匀，取适量，用pH计测定pH值后取平均值，每份样品平行2份。结果(见表2)。

2.4肉苁蓉标准汤剂UPLC指纹图谱的建立

2.4.1色谱条件:采用Waters HSS T3色谱柱(2.1×100 mm，

1.8μm);以甲醇为流动相A，以0.1%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱(0～4 min，34%A;4～10 min，34%→40%A;10～15 min，40%→46%A;15～17 min，46%→34%A;17～20 min，34%A);流速0.3 mL·min－1;柱温30℃;检测波长330 nm;参比溶液进样量1μL，供试品溶液进样量0.4μL。

2.4.2参比溶液的制备:取对照品松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷适量，精密称定，置10 mL棕色量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成上述4个成分浓度分别为0.196、0.234、0.228、0.213 mg·mL－1的溶液，即得混合对照品溶液。

2.4.3供试品溶液的制备同2.1.3项。

2.4.4精密度试验:取同一批肉苁蓉标准汤剂(GH-3)的供试品溶液，按2.4.1项下色谱条件连续进样6次，以毛蕊花糖苷(4号峰)为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.2%，相对峰面积的RSD均小于5.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.5稳定性试验:取同一批肉苁蓉标准汤剂(GH-3)的供试品溶液，按2.4.1项下色谱条件，分别于制备后在0，2，4，8，12，16，20，24，28 h进样，以毛蕊花糖苷(4号峰)为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.3%，相对峰面积的RSD均小于4.8%，表明供试品溶液在28 h内稳定性良好。

2.4.6重复性试验:取同一批肉苁蓉标准汤剂(GH-3)，按2.1.3项下方法平行制备6份溶液，按2.4.1项下色谱条件分析，记录色谱图，以毛蕊花糖苷(4号峰)为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.2%，相对峰面积的RSD均小于3.8%，结果表明方法的重复性良好。

2.4.7指纹图谱的建立:按2.1.3项制备14批肉苁蓉标准汤剂的供试品溶液，按2.4.1项下色谱条件进样测定，得到14批肉苁蓉标准汤剂的UPLC指纹图谱。将14批供试品溶液的 UPLC 指纹色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”( 2012 版) 软件以 SI 为参照图谱，以 0. 1 的时间宽度进行峰匹配，采用中位法生成肉苁蓉标准汤对照指纹图谱 R( 见图1) ，同时计算相似度，结果( 见表 3) 。由匹配图谱可以看出在肉苁蓉标准汤剂中有 6 个共有峰。根据 6 个共有峰的峰面积及保留时间计算出相对保留时间〔峰号( 平均相对保留时间) 〕分别为峰 1 ( 0. 434 ) 、峰 2 ( 0. 643 ) 、峰 3 ( 0. 919 ) 、峰 4( 1. 000) 、峰 5( 1. 635) 、峰 6 ( 1. 858) ; 相对峰面积，〔峰号( 平均相对峰面积) 〕分别为峰 1 ( 6. 340 ) 、峰 2 ( 0. 890 ) 、峰 3( 0. 295) 、峰 4( 1. 000) 、峰 5( 0. 674) 、峰 6( 0. 0190) ，指认了其中的 1 号峰为松果菊苷、3 号峰为管花苷 A、4 号峰为毛蕊花糖苷、5 号峰为异毛蕊花糖苷; 相似度分析表明，14 批标准汤剂与对照图谱之间相似度在 0. 789 ～ 0. 999 之间( 见图 2) 。

3.2供试品溶液进样量的考察标准汤剂中指标成分的含量测定试验中，供试品进样量为10μL时，肉苁蓉标准汤剂图谱中毛蕊花糖苷均未出峰，仅有松果菊苷出峰，管花肉苁蓉标准汤剂图谱中虽松果菊苷和毛蕊花糖均出峰，但是松果菊苷和毛蕊花糖苷峰面积均较小，且发现供试品色谱图在溶剂峰位置出一个很高的峰。经分析是因为供试品定容为无水乙醇不含水，且与对照品的配制溶剂50%甲醇不一致，导致明显的溶剂效应，使得松果菊苷和毛蕊花糖苷无保留，部分样品松果菊苷和毛蕊花糖苷出峰是因为其含量相对较高，有部分保留。分别调整供试品进样量为5、3μL考察溶剂效应的消除效果，结果表明供试品进样量为3μL时，可完全消除溶剂效应，松果菊苷可正常出峰，故供试品进样量定为3μL。同样地，通过供试品溶液进样量的考察消除了标准汤剂指纹图谱测定时产生的溶剂效应，确定最佳进样量为0.4μL。

3.3肉苁蓉标准汤剂指纹图谱相似度低的原因探讨14批肉苁蓉及管花肉苁蓉标准汤剂指纹图谱的相似度范围在0.789～0.999之间。相似度最低批次是RCR-9标汤为0.789。其他批次相似度均0.98以上。RCR-9标汤与其他样品比较，其整体的相似度都不高。从RCR-9标汤的指纹色谱图可看出其相对其他样品在保留时间12.278、15.466处有两个较明显的峰。由于中药中化学成分复杂，因此生长环境、采收时间、加工方式等的不同导致饮片的物质积累不同、成分含量均会存在差异。RCR-9标汤相似度较低可能是因为种种因素导致该批饮片的物质积累与其他批次有所不同。

3.4肉苁蓉标准汤剂的质量控制本实验分析了14批肉苁蓉标准汤剂的出膏率、pH值以及松果菊苷和毛蕊花糖苷的转移率。14批肉苁蓉标准汤剂的出膏率范围为25.1%～56.6%，其中由于管花肉苁蓉饮片相对肉苁蓉饮片含糖量低，所以管花肉苁蓉标准汤剂的出膏率均较肉苁蓉标准汤剂的出膏率低一些。14批肉苁蓉标准汤剂的pH值范围在4.30～5.15之间，由此可见肉苁蓉标准汤剂的酸碱度较稳定。14批肉苁蓉及管花肉苁蓉标准汤剂松果菊苷转移率平均值为22.99%，毛蕊花糖苷转移率平均值为17.09%，其中管花肉苁蓉饮片制备标准汤剂指标成分转移率相对较稳定，而肉苁蓉饮片制备标准汤剂指标成分转移率批间差异相对较大一些。

4结论

本研究采用UPLC法建立了肉苁蓉标准汤剂的指纹图谱，可全面反映和评价肉苁蓉标准汤剂的内在质量。肉苁蓉标准汤剂的出膏率、指标成分转移率、指纹图谱分析结果均表明制备得到的14批肉苁蓉标准汤剂整体均一性良好，其制备方法与临床一致，质量可控，有助于标准化肉苁蓉不同用药形式，保障药物临床疗效的一致性，解决因生产工艺、制备方法的不同而造成的质量差异问题。

参考文献

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