肉苁蓉对卵巢早衰大鼠免疫因子和凋亡相关蛋白的影响

刘涛1a，殷松1b，,栾昕2

(1.延安大学医学院,&药理学教研室;b.生理学教研室，陕西延安716000;2,延安市人民医院手术麻醉科，陕西延安716000)

摘要：目的探讨肉苁蓉对卵巢早衰大鼠免疫因子和凋亡相关蛋白的影响及其作用机制。方法按照体重将SD大鼠随机分为5组:正常组、模型组和低、中、高3个剂量实验组，每组10只。用雷公藤多昔50 ag•g"给予大鼠制备卵巢早衰大鼠模型。低、中、高3个剂量实验组分别给予5,10,20 g-kg'1肉女蓉。用酶联免疫吸附法检测大鼠促卵泡激素(FSH)、雌激素和抗苗勒管激素(AMH)水平;以实时定量聚合酶链反应检测肿瘤坏死因子-a(TNF-a)和干扰素-丫(IFN--y)的基因相对表达水平;以免疫印迹法检测B淋巴细胞瘤-2(Bel-2)和B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)蛋白相对表达水平。结果正常组、模型组和低、中、高3个剂量实验组的FSH水平分别为(16.42±1.76),(31.83±2.67),(25.89±2.48),(23.73±2.05)和(21.55±2.94)U•L”；上述这5组的雌激素水平分别为(97.64±7.85),(53.47±6.98),(89.56±7.28),(93.35±6.29)和(92.45±5.60)ng•「'；上述这5组的AMH水平分别为(280.84±22.42),(149.35±14.57),(231.71±27.38),(253.33±27.36)和(265.64±25.34)pg•mL"；上述这5组的TNF-a基因的相对表达水平分别为1.00±0.00,3.54±0.35,2.41±0.27,2.32±0.25和2.13±0.21；上述这5组的IFN-y基因的相对表达水平分别为1.00±0.00,4.45±0.98,2.93±0.31,2.85±0.29和2.67±0.26；上述这5组的Bel-2蛋白的相对表达水平分别为0.72±0.05,0.28±0.04,0.42±0.04,0.51±0.06和0.64±0.07；上述这5组的Bax蛋白的相对表达水平分别为0.48±0.04,1.05±0.07,0.86±0.08,0.69±0.07和0.53±0.06。模型组与正常组比较，或者低、中、高3个剂量实验组与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论肉苁蓉能够调控FSH、雌激素和AMH的水平，抑制TNF-a和IFN-y基因的表达，其可能通过调控性激素因子及Bcl-2/Bax蛋白的平衡从而影响卵巢早衰。

关键词：肉苁蓉;卵巢早衰;免疫因子;B淋巴细胞瘤-2；B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白

DOI：10.13699/j.enki.1001-6821.2019.23.036

中图分类号:R28文献标志码：A文章编号：1001-6821(2019)23-3084-04

卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是指卵巢内激素水平不平衡导致的卵巢功能障碍⑴。卵巢颗粒细胞的凋亡和细胞免疫因子均与POF的发生密切相关⑵。肉苁蓉(Cistanches Herba,CH)可以通过清除胚胎体外培养产生的自由基，提高胚胎体外发育率⑶。本实验研究肉苁蓉对POF大鼠免疫因子和凋亡相关蛋白的影响及其作用机制。

材料与方法

1材料

动物SPF级12周龄的SD雌性大鼠，体重250 g左右,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。动物许可证号:SCXK(沪)2007-0005。

药品与试剂肉苁蓉药材,购自承德医学院附属医院附属中药房同济大药房药剂科，经陕西中医药大学丁延平教授鉴定确为肉苁蓉，参考杨志蓉等⑶方法，制成剂量为50 mg•mL-'肉苁蓉溶液)。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒，购自南京Vazyme生物公司；免疫组化所用试剂，购自福州迈新公司；二辛可酸(BCA)试剂盒，购自碧云天生物技术研究所。

2.4以qRT-PCR测定肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、干扰素-WFN-r）、B淋巴细胞瘤-2（Bel-2）和B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（Bax）基因的表达水平⑸分组与处置见“2.2”。提取卵巢组织总RNA,逆转录成eDNA后，按照qPCR说明书进行qRT-PCR扩增。循环条件：95 X.30 s,60 30 s；72 Y 30 s,共40个循环；60龙延长5 min；基因的相对表达量用2-AAQ仪器荧光显微镜，德国ZIESS公司产品；Multiskan MK3酶标仪，美国Thermo公司产品。

2实验方法

2.1 POF大鼠模型的制备⑷

大鼠用雷公藤多昔50 jig•g-1连续灌胃14 d,建立POF大鼠模型。

2.2分组与给药"T

将造模成功大鼠随机分为4组:模型组和低、中、高3个剂量实验组，每组10只。10只正常SD大鼠作为正常组。于造模结束后24 h,低、中、高3个剂量实验组分别给予5,10,20 g•kg-'肉苁蓉，连续灌服20 d。模型组与正常组大鼠自由饮水。自中药灌胃第11天起，每日进行大鼠阴道脱落细胞涂片观察，连续10 d,观察并记录大鼠动情周期。

2.3以酶联免疫吸附法(ELISA)检测促卵泡激素(FSH)、雌激素和抗苗勒管激素(AMH)水平⑷分组与处置见“2.2”。大鼠于间情期，腹主动脉取血，静置30 min,以3000 r-mini离心，取上清液，按照EUSA试剂盒说明书要求，于酶标仪450 nm波长处测定光密度(0D)值,即代表FSH、雌激素和AMH水平。

2.5以免疫印迹法检测Bel-2和Bax蛋白表达⑸

分组与处置见2.2。提取各组卵巢组织蛋白，定量。按照文献方法操作。成像后，用Quantity One凝胶分析软件处理,测定各组蛋白条带的OD值,以目的条带和P-actin条带的比值作为蛋白表达水平。

2.6以免疫组化染色检测TNF-a和IFN-丫蛋白表达水平⑷

分组与处置见“2.2”。腹主动脉取血后，即刻剖腹取卵巢，置于4%多聚甲醛液中固定24 h,脱水后石蜡包埋，切片脱蜡，蒸馋水洗2 min,抗原修复，滴加鸟。2阻断内源性过氧化物酶,再用血清封闭，清洗3次后,加入一抗孵育30 min后,4 2过夜。再加酶标二抗,37 Y孵育20 min；加二氨基联苯胺显色，苏木素复染，脱水后封片，显微镜下观察染色结果。以TNF-a及IFN-7表达的积分OD值代表其蛋白表达水平，每张切片随机取5个视野。

讨论

卵巢早衰大鼠中IFN-7的水平明显升高⑹。本研究结果发现，低、中、高3个剂量实验组大鼠性激素FSH含量显著降低，雌激素、AMH含量显著升高；TNF-a、IFN->和Bax表达显著降低；Bel-2表达水平显著升高，而Bel-2/Bax的比值显著升高。由此可见，肉苁蓉可以通过调节大鼠性激素水平，抑制TNF-a和IFN-)的表达来减少卵泡闭锁和细胞凋亡，进而减缓卵巢衰竭速度；肉苁蓉还可以上调Bel-2/Bax。表明肉苁蓉有抑制卵巢早衰的作用，其机制可能与卵巢的性激素水平、TNF_a、IFN-)及凋亡相关蛋白Bel-2/Bax表达有关。