肉苁蓉对负荷运动小鼠肝脏NOS3表达的影响

杨宏新侯金凤杨勇1王妍闫晓红

(内蒙古医学院细胞生物教研室·呼和浩特010059 1内蒙古自治区医院肿瘤科·呼和浩特010017)

摘要目的:观察肉苁蓉对负重游泳小鼠肝脏组织结构和糖原的影响,探讨其抗疲劳效应的相关分子机制。方法:将昆明小鼠随机分为正常对照组、运动对照组和肉苁蓉实验组。正常对照组和运动对照组每只每日灌胃生理盐水0.2ml,肉苁蓉实验组每只每日灌胃肉苁蓉水煎液0.2ml(3g/Kg),共15天;末次给药1小时后运动对照组和肉苁蓉实验组小鼠尾部负重5游泳90分钟,10小时后连同正常对照组小鼠处死取肝脏,用中性甲醛固定制备石蜡切片;常规HE染色观察肝脏组织结构,糖原染色法显示肝脏糖原,S-P免疫组织化学染色法检测小鼠肝脏一氧化氮合酶3的表达。结果:运动对照组与正常对照组比较肝脏结构损伤严重,糖原含量减少,一氧化氮合酶3表达下降(P<0.05);肉苁蓉实验组与运动对照组比较肝小叶结构较清晰,糖原丰富,一氧化氮合酶3表达上调(P<0.05)。结论:肉苁蓉可保护负重游泳小鼠肝脏肝细胞和内皮细胞受损,上调一氧化氮合酶3的表达,促进肝糖原合成,从而发挥抗疲劳作用。

主题词   肉苁蓉/药理学肝/药物作用疲劳/病理学小鼠

肉苁蓉,又名大芸,为列当科二年寄生草本植物。性味甘、咸、温,入肾、大肠经,主要功用是补肾壮阳、益精血、润肠通便,常用于治疗阳痿,不孕,腰膝酸软,筋骨无力,肠燥便秘等症状,在历代增力的中药古方中,出现率最高[1],素有“沙漠人参”之称。明代李时珍说:“补而不峻,故有苁蓉(从容)之号”。

肝糖原含量是检测保健食品抗疲劳作用的重要指标[2]。本研究旨在通过小鼠负重游泳试验,观察肉苁蓉对负重游泳小鼠肝脏组织结构及肝脏糖原的影响,并首次通过检测肝脏一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase3,NOS3)的表达量,研究NOS3和糖原合成的关系,探讨肉苁蓉提升运动能力的可能分子机制。

1材料

1.1动物30只雄性昆明种小鼠,清洁级,体重(20±0.5)g,由内蒙古大学动物中心提供。

1.2药品及试剂肉苁蓉(Cistanche deserticola Y.C.Ma)产于内蒙古额吉纳旗并已鉴定。水煎浓缩成相当于每毫升含生药1g的水煎液原液,4℃冰箱保存。一氧化氮合酶3(NOS3)多克隆抗体:武汉博士德生物工程有限公司。S-P试剂盒:福建迈新试剂公司。

1.3仪器JD-80彩色图像分析仪:南京。

2方法

2.1动物分组、给药及处理昆明种小鼠适应饲养3天后,随机分为正常组、运动组、肉苁蓉组3组,每组10只。正常组和运动组灌服生理盐水,肉苁蓉组灌服肉苁蓉水煎液,每日1次,0.2ml/次,连续15天。末次给药1小时将运动组、肉苁蓉组两组小鼠尾部负重1g(5 W)铅坠,放入高50cm、长50cm、宽35cm的水池中游泳,温度保持在(30±0.5)℃,观察小鼠,小鼠停止游泳用木棍刺激其运动,持续90分钟,运动后正常饮食。

2.2肝脏组织学观察休息10小时后连同正常组小鼠脱颈法处死,取出肝脏,10中性甲醛固定,经脱水、透明、浸蜡、包埋制成4μm厚的连续切片,切片采用HE染色法观察各组肝脏组织结构。

2.3糖原染色4μm厚的连续切片常规脱蜡至水,入1过碘酸液37℃15分钟,流水冲洗后入Schiff液作用60分钟,流水冲洗,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,镜下观察染色结果。

2.4NOS3表达的测定免疫组织化学染色法检测。分析方法:在光镜下以目测半定量法初步观察,NOS3阳性产物呈深棕黄色或棕黄色,阳性产物定位于肝细胞的胞浆内或肝细胞间的内皮细胞的胞浆内,蓝色背景为阴性。然后采用彩色图像分析系统分析,测量阳性反应物的灰度值,在40倍物镜下每张片子随机测量4个视野的参数取其平均值,用此参数反映NOS3染色强度的变化。

2.5统计分析数据以(x±s)表示,采用SPSS11.0统计软件包进行t检验。

3结果

3.1肝脏组织结构变化 正常对照组肝小叶结构清晰,细胞索排列整齐,肝窦正常,肝细胞无明显病变,核结构清晰。运动组正常组织结构消失,小叶界限不清,细胞索紊乱,大部分肝窦消失;肝细胞广泛性的空泡变性,表现为细胞体积增大,胞浆疏松、浅染,乃至清亮、透明,部分肝细胞呈典型的气球样变,可见少量灶性或点状坏死。肉苁蓉组肝细胞呈轻度浊肿,但排列规整,细胞内无明显空泡及疏松,细胞索排列较整齐,细胞核结构较清晰。

3.2肝糖原染色结果 正常肝细胞中均有糖原存在,分布均匀,无空泡现象(见图1-1)。运动组糖原较少,散在分布在肝细胞,部分区域出现空泡现象(见图1-2)。肉苁蓉实验组糖原丰富,但在细胞的一侧聚集很多(见图1-3)。

3.3光镜观察NOS3的表达及图像定量分析

正常组肝细胞的细胞质中有强阳性表达呈弥散状分布尤其在双核细胞中有强阳性表达,内皮细胞有阳性表达(见图2-1)。运动组肝细胞和内皮细胞的细胞质中表达均减弱(见图2-2)。肉苁蓉组肝细胞的细胞质有阳性表达,内皮细胞中有强阳性表达(见图2-3)。分析结果见表1。

4讨论

糖是维持人体运动能力的主要能源物质,糖原是可以迅速动用的葡萄糖贮备,机体内糖贮备减少,必将引起运动能力下降。糖在人体内的总量一般不超过500g,在体内分布:肝糖原有70～100g;体液糖20g,主要是葡萄糖,其中血糖约6g,肌糖原350～400g。大量运动时,肌糖原分解供肌肉收缩,当肌糖原耗竭时,为维持血糖水平,肝糖原迅速分解成葡萄糖并将其释放入血,当肝糖原贮备耗竭时,葡萄糖的产生会明显下降,导致低血糖。血糖是包括大脑在内的中枢神经系统的主要能源物质,若血糖水平很低,便会出现低糖症,致使脑机能下降,大脑不能维持正常功能,出现疲劳和虚弱表现[3],过度疲劳会使运动员不仅表现为疲乏无力、精神萎靡、头脑思维混乱等症状,甚至被迫停止训练,有的甚至出现心肾功能的改变。运动员大量运动后如何促使运动员体能迅速恢复成为运动学界研究的重点课题。

大量研究证明机体大量运动后,会产生大量H+、自由基、乳酸等影响细胞正常代谢的物质,同时由于细胞内葡萄糖的匮乏导致机体发生运动性疲劳和细胞损害。本研究结果显示,大量运动后肝脏组织结构损害非常严重,同时也影响到细胞的合成代谢,如肝糖原减少。服用肉苁蓉的小鼠在大量运动后可观察到肝脏损害减轻,且肝糖原含量显著多于运动组,显示肉苁蓉具有肝脏保护作用,可促进糖原合成,维持机体正常的生理机能。

NO是近几年被运动界高度重视的一个小分子物质,一氧化氮合酶(NOS)是NO生成的主要限速因子,目前已经确认NOS有3种类型的同工酶,它们分别为NOS1(nNOS)、NOS2(iNOS)、NOS3(eNOS)。eNOS:即NOS3,内皮型一氧化氮合酶,主要分布于内皮细胞、肝细胞,生成的NO主要参与生理功能,如保持血管舒张、增加血流量、调节血压、抑制血小板凝集、维持细胞的正常代谢等[4];nNOS:即NOS1,被称为神经元型一氧化氮合酶,它存在于神经元细胞、骨骼肌细胞等,主要参与神经发育、神经分泌、学习和记忆过程;iNOS:即NOS2,被称为诱导型一氧化氮合酶,主要存在于平滑肌细胞、巨噬细胞、淋巴细胞中,此酶一旦诱生,可持续合成NO,直至底物耗尽或细胞死亡,目前认为参与细胞损伤[5]。

本研究结果表明大量运动后内皮细胞和肝细胞NOS3表达减弱,由此产生的NO减少,使血管不能有效扩张,血流量减少,合成糖原的原料不能运输到肝细胞,故糖原合成减少;肉苁蓉可上调内皮细胞和肝细胞的NOS3表达,反应性扩张血管、增加血流量、加快运输糖原合成原料的能力,加速糖原合成,维持机体处于正常生理代谢水平。故上调NOS3的表达可能是肉苁蓉提升运动能力、保护肝脏和减轻运动性疲劳的重要作用机制。

参考文献

1周志锦.肉苁蓉的研究进展.中医药信息,1995,13(5):28.

2何米英,严卫星.抗疲劳试验中肝糖原测定的意义探讨.中国食品卫生杂志,1998,10(6):1.

3陈岷,叶子坚,李琼.运动中糖的分解代谢.中国临床康复,2004,8(33):7519.

4徐健方,张漓,冯连世.运动与NO NOS系统和CO HO系统的研究进展.中国运动医学杂志,2004,23(4):453.

5吴惺,陈彦克,马廉亭.诱导型一氧化氮合成酶在迟发性血管痉挛中的作用.中华实验外科,2005,22(2):203.