肉苁蓉多糖的纯化及其对T细胞功能调节的研究

浙江医科大学公共卫生学院微波教研室   曾群力 毛俊浩 吕志良

摘要目的：研究肉苁蓉主要成分之多糖对小鼠胸腺T细胞的功能调节。方法:采用沉淀法获肉苁蓉粗多糖，以DEAE-Sephadex A-50和Sephacryl S-200柱层析，获得肉苁蓉多糖(CDPS)。再釆用庭哩蓝比色法(MTT)观察CDPS对小鼠脾、胸腺淋巴细胞增殖反应的影响及对正常小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2的影响。结果:CDPS纯化后经Sephacryl S-200鉴定为单一对称峰。CDPS体外实验，在12.5〜200昭/ml浓度范围内，有单独和协同ConA、PHA促进小鼠胸腺淋巴细胞增殖的作用(P<0.01).CDPS在100 pg/ml浓度时，能显著提高小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2的能力.其IL-2活性明显高于对照组(P<0.01).结论：肉苁蓉多糖能增加小鼠脾、胸腺淋巴细胞的增殖反应，且与ConA、PHA有协同刺激小鼠胸腺淋巴细胞增殖的作用；并能显著提高小鼠脾脏T淋巴细胞分泌IL-2。

关键词肉苁蓉/药理学;多糖类/药理学；小鼠；胸腺;T淋巴细胞/药物作用

肉苁蓉为列当科苁蓉植物一一肉苁蓉的干燥带鳞片的肉质茎⑴,在《神农本草经》中被列为上品，具有益精血、补肾助阳、润肠通便、延缓衰老之功能。近代药理学研究表明，它能提高机体免疫功能，促进DNA合成，增强体力，提高智力，具有明显的抗衰老作用口衰老伴有机体免疫功能的下降，有文献报道，肉苁蓉的粗提物具有抗衰老的作用⑸，但对肉苁蓉多糖(CDPS)的免疫调节作用尚未见报道。作者主要进行了CDPS的提取及其对T细胞功能调节作用的研究。

1材料与方法

1.1试剂与药品DEAE-Sephadex A-50,Sephacryl S-200:Pharmacia公司；RPMI 1640培养基:GIBCO公司；HEPES：FARCO公司；L-Glutamine:上海东风试剂厂；青霉素、链霉素：华北制药厂；刀豆球蛋白（ConA）、嚏哩蓝（MTT）：SIGMA公司；植物血凝素（PHA）：上海市医学化验所;疏基乙醇:Fluka公司；新生小牛血清：四季青生物工程公司；其余试剂均为国产分析纯。肉苁蓉（浙江产）：购于杭州市药材公司。

1.2实验动物ICR小鼠，雄性,6~8周龄，体重18〜20 g,购于浙江省实验动物中心。

1.3 CDPS的提取和纯化中药肉苁蓉干燥、切片，经电磨机粉碎成细颗粒状，再经95%热乙醇浸泡3 h后，用纱布过滤，弃滤液。药渣风干后加水煎煮3次，每次1〜2 h,过滤，收集并合并滤液（呈棕红色）。蒸发浓缩后，离心去沉淀，上清液加2〜3倍体积的95%乙醇沉淀，4'C静置24 h过夜，次日，于4€,6000 r/min,离心20 min,收集沉淀。沉淀经水复溶、用中性酶结合Sevag法脱蛋白、透析、冷冻干燥后获粗多糖（灰棕红色），并用苯酚-浓硫酸法测定其糖含量园。

称取一定量的肉苁蓉粗多糖以双蒸水溶解后，经DEAE-Sephadex A-50层析，以苯酚浓硫酸法测定OD 490,并作洗脱曲线，合并主峰。再经Sephacryl S-200凝胶过滤层析，收集OD 490峰值部分，冻干备用使用时用不完全RPMI 1640配制成一定浓度。14脾、胸腺淋巴细胞的制备顷」小鼠脱颈处死，无菌取脾或胸腺，经200目钢网过筛，以含5%新生小牛血清的Hanks液制成单个细胞悬液，于1500 r/min离心10 min后，用0.01 mol/L Tris-NHQ低渗液裂解红细胞1 min,再用Hanks液离心洗涤,最后将细胞悬浮于含10%新鲜小牛血清的RPMI 1640完全培养液中，台盼蓝计数，活细胞〉95%,调整脾细胞浓度为lX107ml,胸腺细胞浓度为4X10'/ml。

5，淋巴细胞增殖反应按Mossman法E］改1.进：96孔细胞培养板，每孔加入IX 107ml脾细胞悬液或4 X 107ml胸腺细胞悬液100』及不同浓度的药物100于5%CO2、37'C培养箱中培养72 h,培养结束前4 h,每孔加入MTT（5 mg/ml）8同,培养结束时每孔吸去150卩1上清，加入0.5 mol/L盐酸异丙醇150贝，于微量震荡器上轻轻震荡使蓝色结晶完全溶解，在酶标仪上测定OD570,每实验孔设3复孔。

1.6 IL-2的诱生及检测釘细胞培养瓶中，加入IXIO'/ml脾细胞悬液2 ml,含5 pg/ml ConA,多糖25 pg/mhl00 fig/ml、200卩g/m!,在5%COz、37'C培养箱中培养48 h后,2500r/min离心1 5min，收集上清液，0.22 fim微孔膜过滤，滤液即为待测样品，-20'C冻存。

96孔细胞培养板，每孔加入4 X 106/ml胸腺细胞悬液100含ConA 5fig/ml,将待测样品经培养液1、2、4、8、16倍比稀释后，每孔加入100卩1,于5%C0z、37C培养箱中培养72 h,培养结束前4 h,每孔加入MTTC5 mg/ml）8卩1,培养结束时每孔吸去150卩1上清，加入0.5 mol/L盐酸异丙醇150国,于微量震荡器上轻轻震荡使蓝色结晶完全溶解,在酶标仪上测定OD 570,每实验孔设3复孔。

2结果

2.1 CDPS的提取结果肉苁蓉经热乙醇浸渍，沸水抽提，乙醇沉淀，中性酶结合Sevag法脱蛋白，可得到肉苁蓉粗多糖,经浓硫酸-苯酚法测定，其糖含量为60%。该粗多糖先后经DEAE-Sephadex A-50（图1）和Sephacryl S-200柱层析分离和纯化得CDP-S,经Sephacryl S-200分子筛鉴定为单一对外 与ConA.PHA两类T细胞刺激剂具有协同 刺激小鼠胸腺淋巴细胞增殖的作用（表1）。

3讨论

肉苁蓉属于一种能调节机体免疫功能、具有抗衰老作用的中药。本研究采用一种较古典的测试方法——MTT法，通过对细胞能量代谢强弱的反应来间接反映淋巴细胞增殖及IL-2诱导的情况。研究结果表明,CDPS单用时对小鼠脾、胸腺淋巴细胞增殖有明显促进作用，并可协同ConA、PHA两类T淋巴细胞刺激剂刺激小鼠胸腺细胞增殖，这与淫羊蕾多糖对小鼠脾、胸腺细胞体外实'验结果是一致的專」。CDPS对活化及未活化的T细胞增殖均有刺激作用，是一种T细胞刺激剂。

IL-2具有诱导Th细胞、Tc细胞增殖，刺激B细胞产生抗体，活化巨噬细胞，增强NK细胞和LAK细胞活性，诱导干扰素产生等效应，是一种极为重要的细胞因子。在肿瘤患者、免疫缺陷疾病及衰老时,IL-2生成减少或IL-2反应性降低本研究发现，较高浓度(100瓯/ml)的CDPS能显著提高小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2,故我们推测CDPS的促IL-2分泌作用可能是肉苁蓉提高机体免疫功能、抗衰老作用的机制之一。

另外,我们对CDPS免疫活性作用的机制也进行了研究，发现其对淋巴细胞激活和增殖早期所呈现的一个重要现象——胞内钙离子浓度升高具有促进作用,CDPS的免疫调节机制是否通过该途径，尚需进一步的研究。

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