肉苁蓉多糖的促淋巴细胞增殖作用

王翔岩,齐云,蔡润兰,李晓红,杨美华,石钺

(中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,北京100193)

【摘要】目的研究肉苁蓉多糖(CDPS)对小鼠淋巴细胞增殖的影响。方法MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖。环磷酰胺(Cy)复制免疫功能低下的动物模型,分别测定正常及免疫低下动物脾脏、胸腺指数。胸腺细胞增殖法测定白细胞介素-2(IL-2)活性。结果CDPS对丝裂原(ConA及LPS)活化淋巴细胞及未活化正常细胞均有明显促增殖作用,并促进淋巴细胞IL-2的分泌。腹腔给药显示CDPS具明显提高正常及免疫低下小鼠的脾指数,对因Cy所致胸腺指数的降低也有显著的对抗作用。结论CDPS可显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖,该作用可能与其促IL-2分泌有关。

【关键词】肉苁蓉多糖;脾指数;胸腺指数;淋巴细胞增殖;白细胞介素-2

【中图分类号】R-9【文献标识码】A【文章编号】1005-4847(2009)06-0424-04

植物多糖因其普遍具有的免疫调节作用及其相对低毒的特点引起人们的广泛关注[1]。肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉(Cistanche deserticola Y.C.Ma)的带鳞片的干燥肉质茎,具有广泛的药理作用。其水煎液可显著提高巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数[2],进一步的研究显示其物质基础为肉苁蓉总多糖(C.deserticola polysaccharide,CDPS)[3],曾群力等[4]发现CDPS中的某单一组分在体外对小鼠胸腺淋巴细胞具明显增殖作用。本文从体内及体外观察了CDPS对(脾)淋巴细胞增殖作用。

1材料与方法

1.1药品与试剂

CDPS由医科院药植所植化室提供,多糖含量87。体内实验用前以生理盐水溶解并稀释至所需浓度,煮沸灭菌。体外实验用前以RPMI-1640培养基溶解稀释,高压灭菌。脂多糖(LPS),刀豆蛋白(ConA),地塞米松(DEX),MTT均为Sigma公司产品。环磷酰胺,中美合资山西泰盛制药有限公司。胎牛血清、RPMI1640培养基、胰蛋白酶均系Gibco产品。其他试剂为国产分析纯。

1.2动物

BALB c幼鼠(SPF级)由维通利华实验动物技术有限公司提供[SCXK(京)2002-2003]。SPF级动物房中饲养,自由采食和饮水。

1.3仪器

Multiskan Ascent酶标仪,美国Thermo Electron公司产品。雷磁PHS-3B型精密pH计,上海精密科学仪器有限公司。Napco 5410型二氧化碳孵箱,美国NAPCO。BCN-1360型超净工作台,北京东联哈尔仪器制造有限公司。XDS-1B倒置显微镜,重庆光电仪器公司。

1.4方法

1.4.1对淋巴细胞增殖的影响:常规制备BABL c

小鼠脾淋巴细胞,用RPMI-1640调整细胞浓度为1×10个mL,接种于96孔培养板,每孔加入细胞悬液100μL,与不同浓度CDPS(对未活化淋巴细胞增殖作用所用CDPS终浓度依次为:6.25、12.5、25、50、100 mg L;对ConA活化的T淋巴细胞增殖所用CDPS终浓度依次为:3.9、7.8、15.6、31.2、62.5 mg L;对LPS活化的B淋巴细胞增殖所用CDPS终浓度依次为:1.56、3.13、6.25、12.5、25 mg L)及ConA或LPS共培养,并以RPMI-1640培养基作为对照。每孔的总体积为200μL,加入丝裂原ConA、LPS时(其对照为含相应浓度ConA或LPS的RPMI-1640),二者的终浓度分别为2.5 mg L和10 mg L。各种处理均作3个平行孔。将培养板置于37℃,5 CO2饱和湿度培养箱中培养68 h,加入MTT继续培养4 h,以MTT法用酶标仪测定A540nm值,检测增殖情况。各组比较时将A540nm值按下式转化为淋巴细胞增殖率:淋巴细胞增殖率=A样品A对照×100。

对正常小鼠免疫器官重量影响:BALB c幼鼠(雄性,4周龄,体质量10～15 g)按体重随机分组,分为空白对照(生理盐水)组,不同给药剂量组[125 mg(kg·bw)和250 mg(kg·bw)],每组11只,每日腹腔注射给药一次,连续给药7 d,颈椎脱臼处死小鼠,取脾脏和胸腺,剔除脂肪及筋膜组织,滤纸吸干表面液体后称重,按脾指数=100×脾重(mg)体重(mg);胸腺指数=100×胸腺重(mg)体重(mg)分别计算每100 mg体重的脾脏指数和胸腺指数。

1.4.3对免疫功能低下小鼠免疫器官重量影

响[7,8]:BALB c幼鼠(雄性,6周龄,体质量15～20 g)按体重随机分组,每组12只,除正常对照组(腹腔注射等体积生理盐水)外,其余各组每日腹腔注射Cy 50 mg(kg·bw),并分别腹腔注射给予受试药液[125和250 mg(kg·bw)],正常对照组及模型组给予相同体积生理盐水,连续13 d,每日1次,实验中观察动物体重变化情况。末次给药后24 h,同1.4.2方法测定并计算脾脏和胸腺指数。

1.4.4对IL-2活性影响:①IL-2的诱生:96孔细胞板中每孔加入50μL不同浓度的CDPS(终浓度依次为:3.91、7.82、15.63、31.25、62.5、125 mg L,对照孔加入50μL培养液)和50μL ConA(终浓度5 mg L),每孔再加入1×10个脾细胞。于37℃,5 CO2饱和湿度培养箱中培养24 h,2500 r min离心20 min,取细胞上清-20℃保存备用。②IL-2活性检测[9,10]:基本方法按文献[9],并据文献[10]进行适当调整。常规制备BALB c小鼠胸腺细胞悬液,96孔细胞培养板每孔接种1×10个胸腺细胞,同时每孔加入50μL ConA(终浓度2.5 mg L),再加入制备好的IL-2上清50μL(空白对照孔加入50μL培养液),共同孵育54 h,加入MTT,继续孵育4 h,1000 r min离心10～15 min,弃上清,每孔加DMSO 100μL,微型振荡器振摇8 min,酶标仪测定A540nm值。

1.5统计分析

数据用均值和标准差(x±s)表示,应用Microsoft Excel软件进行数据整理,并进行t检验,P<0.05和P<0.01为差异有显著性,均具有统计学意义。

2结果

2.1对淋巴细胞增殖的影响

由表1可见,在体外培养的小鼠脾淋巴细胞培养液中加入CDPS,其浓度在25 mg L以上即可显著刺激淋巴细胞增殖,说明CDPS本身有丝裂原样作用。同时,由表2和表3可以看出CDPS对ConA诱导的T淋巴细胞或LPS诱导的B淋巴细胞增殖均有显著的促进作用。

3讨论

ConA和LPS诱导小鼠脾淋巴细胞增殖反应分别是检测机体T和B淋巴细胞功能的体外实验,是反映特异性免疫能力的重要指标。研究显示当CDPS在终浓度25 mg L以上时,可显著促进淋巴细胞增殖,显示其本身具有一定有丝分裂原样作用。在有丝分裂原(ConA或LPS)存在的条件下,更小剂量CDPS即可显示出明显的促增殖活性。我们知道,ConA及LPS分别以诱导T淋巴细胞或B淋巴细胞增殖为主,研究表明CDPS既可促进T淋巴细胞的增殖,又可促进B淋巴细胞增殖,但对B淋巴细胞促增殖作用明显强于T淋巴细胞。

胸腺、脾脏是动物体内主要的免疫器官,脾脏中免疫细胞以成熟的B淋巴细胞为主,胸腺则以未成熟T淋巴细胞为主。胸腺和脾脏指数能反映免疫器官的发育和免疫细胞的功能状况。腹腔注射CDPS能明显提高正常及免疫抑制小鼠的脾指数,对Cy导致的小鼠胸腺萎缩也有显著对抗作用。CDPS对正常动物胸腺指数无明显影响与体外实验CDPS促B淋巴细胞增殖强于T淋巴细胞结果是吻合的。

IL-2是T淋巴细胞从细胞周期G1期进入S期

产生的细胞因子,是一个主要的T细胞生长因子,起一种自分泌生长因子的作用,此外IL-2可促进B细胞增殖与抗体合成[11,12]。CDPS促进淋巴细胞IL-2释放,该作用显然与CDPS促脾淋巴细胞增殖相关。

参考文献

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