肉苁蓉多糖的免疫活性作用及机制

曾群力1,郑一凡1,吕志良2

(1.浙江大学医学院,浙江杭州310006;2.浙江大学生命科学院,浙江杭州310027)

[摘要]目的:研究肉苁蓉多糖(CD PS)的免疫活性作用及其体外免疫调节作用的机制。方法:采用噻唑蓝比色法(M T T)观察CDP S体外对ISO、DEX、TN F-β抑制小鼠胸腺淋巴细胞增殖的调节作用;采用流式细胞仪进行了CD PS对细胞周期及其胞内Ca2+的测定。结果:CD PS在较高浓度能对抗ISO、D EX对淋巴细胞增殖的抑制作用,及对抗高浓度TN F-β对淋巴细胞增殖的抑制作用,协同低浓度TN F-β对淋巴细胞的增殖促进作用;100μg/m、l 200μg/ml CD PS均能使分裂期的细胞明显增加;较高浓度(100μg/ml)的CD PS对小鼠胸腺细胞内Ca离子浓度有明显的促进升高作用。结论:CDP S能促进细胞进入分裂期,并推断其对小鼠胸腺淋巴细胞增殖的促进作用与其促进小鼠胸腺淋巴细胞内钙释放有关。

[关键词]肉苁蓉/药理学;多糖类/药理学;淋巴细胞增殖;细胞周期;Ca2+

[中图分类号]R 979.5[文献标识码]A[文章编号]1008-9292(2002)04-0284-04

肉苁蓉(Cistanche Deserticol a Y C Ma)是我国稀有的名贵中药材,在《神农本草经》中被列为上品,具有益精血、补肾助阳、润肠通便、延缓衰老之功能。近代药理学研究表明,它能提高机体免疫功能,促进DN A合成,增强体力,提高智力,具有明显的抗衰老作用[1]。作者研究了肉苁蓉的一种多糖组分CDPS对小鼠淋巴细胞免疫功能的调节作用。

1材料与方法

1.1试剂与药品RPM I 1640培养基:GIB-CO公司;HEPES:FARCO公司;L-谷氨酰胺:上海东风试剂厂;青霉素、链霉素:华北制药厂;刀豆球蛋白(ConA)、M T T:SIGM A公司;植物血凝素(PHA):上海市医学化验所;异丙肾上腺素(ISO):上海市天丰药厂;巯基乙醇:Fluka公司;新生小牛血清:四季青生物工程公司;地塞米松(DEX)为浙江大学医学院附属第一医院马量医师赠送;肿瘤抑制因子(TN F)为浙江大学生命科学院细胞教研室余越汉老师提供;其余试剂均为国产分析纯。

1.2实验动物ICR小鼠,雄性,6～8周龄,体重18～20 g,22只,购于浙江省实验动物中心。

1.3肉苁蓉多糖的提取肉苁蓉多糖由本室自行提取[2]:生药肉苁蓉粉碎后,经热乙醇浸渍,沸水抽提,乙醇沉淀,中性酶结合Sev ag法脱蛋白,阴离子DEAE-Sephadex A-50交换层析,Sephacryl S-200凝胶过滤层析,得到肉苁蓉多糖(CDPS)单一组分。干燥保存,临用前用不完全RPM I1640配成一定浓度,超滤灭菌。

1.4脾、胸腺淋巴细胞的制备[3]小鼠脱颈处死,无菌取脾或胸腺,经200目钢网过筛,以含5%新生小牛血清的Hanks液制成单个细胞悬液,于1500 r/min,10 min离心后,用0.01 m ol/L Tris-N H4 Cl低渗液裂解红细胞1 min后,再用Hanks液离心洗涤,最后将细胞悬浮于含10%新鲜小牛血清的RPM I 1640完全培养液(含2 m mol/L L-谷氨酰胺,100 mm ol/L丙酮酸钠,1 m mol/L巯基乙醇,临用前加入青霉素100 U/m l和链霉素100μg/ml)中,台盼蓝计数,活细胞>95%,调整脾细胞浓度为1×10/ml,胸腺细胞浓度为4×10/ml。

1.5淋巴细胞增殖反应按Mo sma nn法[4]改进:96孔细胞培养板,每孔加入1×106/ml脾细胞悬液或4×106/ml胸腺细胞悬液100μl及不同浓度的药物100μl,于5%CO2,37℃培养箱中培养72 h,培养结束前4 h,每孔加入M T T(5 mg/ml)8μl,培养结束时每孔吸去150μl上清,加入0.5 N盐酸异丙醇150μl,于微量震荡器上轻轻震荡使蓝色结晶完全溶解,在酶标仪上测定OD570,每实验点设为三复孔。

1.6对细胞周期影响的测定24孔细胞培养板,每孔加入4×106/ml胸腺细胞悬液1 m l,补加各种试剂及多糖溶液至2 ml,于5%CO2,37℃培养箱中培养72 h后,1500 r/min,离心15 min,弃上清,沉淀的细胞加入70%的乙醇固定,4℃保存备用。测试时,细胞经PBS洗涤两次,1500 r/min,离心15 min,弃上清,加入0.5 m l 0.1%RNase A,于4℃酶解30 min后,50μg/m l溴乙碇避光4℃染色30 min,细胞样品在FACSca n f low cytometer上检测荧光强度,每一样品收集10000个细胞测试点,数据采用M ulticycle软件分析。

1.7细胞内钙离子浓度的测定[6]同上方法取小鼠胸腺细胞,用不完全RPM I1640培养液悬浮,调其细胞浓度至1×107/ml。每实验管加入1 ml的胸腺细胞悬液和1μM Fluo-3AM染液5μl,25%F-127 5μl,于37℃温育30 min后,用不完全RPM I1640洗两次,1500 r/min,离心10 min,弃上清,沉淀的细胞加不同浓度的多糖和Co nA后在FACScan f low cytom eter上检测荧光强度,每一样品收集10 000个细胞测试点,数据采用CELLQU EST软件分析。

1.8统计学方法用方差分析,细胞周期和钙离子测定采用流式细胞仪自身所带软件分析。

2结果

2.1肉苁蓉多糖体外对ISO、D EX、TN F-β抑制小鼠胸腺淋巴细胞增殖的调节β-肾上腺素受体的激动剂异丙肾上腺素(ISO)和一类肾上腺皮质激素-地塞米松(DEX)有抑制淋巴细胞增殖的作用,CDPS在较高浓度(75、125μg/ml)能对抗ISO、DEX对淋巴细胞增殖的抑制作用(P<0.01)。见图1。肿瘤坏死因子(TN F-β)在高浓度时对淋巴细胞的增殖呈抑制作用,而较高浓度的CDPS(125μg/m l)可以对抗TNF-β的抑制作用,且协同低浓度TN F-β对淋巴细胞的增殖促进作用(图2)。

2.2肉苁蓉多糖对胸腺淋巴细胞周期的调节CDPS 25μg/ml、100μg/ml、200μg/ml三个浓度分别作用于小鼠胸腺淋巴细胞72 h后,经FACS测定细胞内DN A含量,根据公式S+G2×100%计算增殖指数(PI)。结果表明,100μg/ml、200μg/ml均能使分裂期的细胞明显增加,两者的增殖指数(68.0%,56.6%)均明显高于对照组(44.6%),其中200μg/ml组略低于100μg/m l组,因为在200μg/ml浓度时,其对细胞的增殖作用已成下降趋势[7]。而25μg/ml组的P I值(47.5%)比对照组无明显增高。