肉苁蓉多糖对D-半乳糖致衰老小鼠抗疲劳作用及机制研究

闫 磊 胡江平 孙晓冬蔡克瑞△

(牡丹江医学院组胚教研室，黑龙江 牡丹江157011)

【摘要】目的研究肉苁蓉多糖(CDP)对D-半乳糖致衰老小鼠抗疲劳的作用及其机制。方法将80只昆明种小鼠随机分为正常对照组、模型组、CDP低剂量组和CDP高剂量组，每组20只。模型组、CDP低剂量组和CDP高剂量组予D-半乳糖100 mg/kg颈背部皮下注射造模，正常对照组予等剂量0.9%氯化钠注射液颈背部皮下注射，连续30 do造模同时，CDP低剂量组及CDP高剂量组分别予CDP 100.400 mg/kg灌胃，对照组和模型组予100 mg/kg蒸德水灌胃，每日1次，连续30 do比较4组小鼠负重游泳时间，血清尿素氮(BUN)、乳酸(LA)水平，肝糖原、肌糖原含量，肝组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性。结果模型组小鼠负重游泳时间少于正常对照组(P<0.05)；与模型组相比，CDP低剂量组及CDP高剂量组小鼠负重游泳时间明显增加(P<0.05)o模型组小鼠血清BUN及LA水平明显高于正常对照组(P<0.05)；与模型组相比，CDP低剂量组及CDP高剂量组小鼠血清BUN及LA水平明显降低(P<0.05)o模型组肝糖原及肌糖原含量明显低于正常对照组(P<0.05)；与模型组相比，CDP低剂量组及CDP高剂量组肝糖原及肌糖原含量明显升高(P<0.05)o与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织SOD及GSH-PX活性降低(P<0.05),MDA活性升高(P<0.05)；与模型组相比,CDP低剂量组及CDP高剂量组小鼠肝组织SOD及GSH-PX活性升高(P<0.05),MDA活性降低(尸<0.05)。结论CDP对D-半乳糖致衰老小鼠具有抗疲劳的作用，这种作用可能与降低血清BUN、LA含量，增加肝糖原、肌糖原含量，增强抗自由基损伤有关。

【关键词】肉苁蓉;半乳糖;抗衰老药(中药)；疲劳；自由基;动物，实验

【中图分类号】R339.38；R965.1；R285.5【文献标识码】A【文章编号】1002-2619(2019)01-0096-05

衰老是指人体细胞及组织在结构和功能上出现的退行性变化现象，主要表现为器官质量减轻,细胞萎缩,胞质色素沉着，功能代谢下降,适应能力减弱，抗病能力低下等。肉苁蓉为国家二级保护植物，含多种活性成分,多糖是其主要活性成分之一。近年来，肉苁蓉以其独特的医疗及保健功效在治疗疾病、保障健康中发挥着重要的作用，为医药领域研究的热点之一,相关研究主要集中在抗运动性疲劳、抗衰老、免疫调节及补肾壮阳等方面⑴。抗疲劳能力减弱也是衰老的一个典型特征A3］。本研究通过用D-半乳糖建立小鼠衰老模型，观察肉苁蓉多糖（CDP）对衰老小鼠的抗疲劳作用及其机制，结果如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物昆明种小鼠80只，雄性，体质量18-22 g,购自牡丹江医学院实验动物中心，动物许可证号:SCXK（黑）2015-001。

1.1.2主要药物及试剂肉从蓉生药片（购自牡丹江新特药公司，产地内蒙古，批号20121025）；D-半乳糖（上海化学试剂总厂试剂二厂）；尿素氮（BUN）、乳酸（LA）试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；肝糖原、肌糖原酶联免疫检测（ELISA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶（SOD）,丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH _PX）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.3主要仪器自制游泳箱（规格70 cmx 50 cmx40 cm）；722型可见分光光度计（安捷伦科技上海分析仪器有限公司）;Scout-II型半自动生化分析仪（意大利Menarini公司）；5417R小型台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；fs-n型高速电动匀浆机（江苏金坛金城国胜实验仪器厂）；恒压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）；R201D旋转蒸发仪、真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2方法

CDP制备肉苁蓉生药片150 g,经热乙醇浸泡3 h后,纱布过滤后弃滤液。药渣加水煎煮3次，每次11.2.1~2 h,过滤后合并滤液，减压浓缩至与原生药比为1：1.5,蒸发浓缩后离心、去沉淀，上清液加2~3倍体积的95%乙醇沉淀,4°C静置24 h。4龙，6 000 r/min离心20 min,收集沉淀。沉淀经水复溶、脱蛋白透析、冷冻干燥后获粗多糖。

1.2.2分组及模型制备将80只昆明种小鼠按随机数字表法分为正常对照组、模型组、CDP低剂量组和CDP高剂量组，每组20只。每日上午，模型组、CDP低剂量组和CDP高剂量组予D-半乳糖100 mg/kg颈背部皮下注射,正常对照组予等剂量0.9%氯化钠注射液颈背部皮下注射，连续30 d。

1.2.3给药方法造模同时,CDP低剂量组及CDP高剂量组分别予CDP 100,400 mg/kg灌胃，正常对照组和模型组予100 mg/kg蒸馆水灌胃，每日1次，连续30 d。

1.3观察指标及方法

1.3.1负重游泳实验宀5］各组小鼠末次灌胃30 min后，尾部负荷10%体质量的铅丝，放入自制游泳箱，水深30 cm,水温保持（30.0±0.5）°C游泳。用秒表记录小鼠自游泳开始至体力耗竭的时间，即负重游泳时间。小鼠头部沉入水中10 s不能浮出水面为体力耗竭。

1.3.2血清BUN及LA测定⑷负重游泳实验结束后，拔眼球采血2 mL,肝素抗凝,3 000 r/min离心10 min,分离血清。以比色法测定血清BUN、LA含量,操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.3肝糖原和肌糖原含量测定处死各组小鼠，剖腹取肝脏(200 mg)，剥离小鼠股四头肌，称取200 mg后，分别加入0.9%氯化钠注射液，高速匀浆机研磨(15 000 r/min)，制备10%的组织匀浆，离心15 min(6 000 r/min)，取上清液。严格按照试剂盒说明书检测肝糖原和股四头肌糖原含量。

1.3.4肝组织SOD、MDA及GSH-PX活性测定

取适量肝脏组织(200 mg)，加入液氮研磨，利用试剂盒提供的匀浆介质制备10%肝组织匀浆后，分别用黄喋吟氧化酶法、分光光度法和比色法检测SOD、MDA及GSH-PX活性,具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

3讨论

衰老是机体结构、功能无法避免的退行性变,且不可逆转。随着全球老龄化的加剧，衰老及抗衰老已成为世界范围内的研究热点。目前，针对衰老病因的学说很多，但人体衰老的过程异常复杂,单一学说难以解释。中医学认为，先天禀赋不足,后天调摄失宜，人体精华物质耗散，五脏功能虚损，导致气血生化乏源、代谢失常，出现形体衰惫、疲劳、生命功能减退等现象;气滞、痰凝、血瘀等病理产物也是衰老的重要成因⑹。《灵枢•天年》曰:“人之始生……以母为基，以父为楣……血气已和，营卫已通，五脏已成，神气舍心,魂魄毕具，乃成为人。”《素问•上古天真论》曰：“女子七岁，肾气盛……丈夫八岁，肾气实，发长齿更;二八肾气盛，天癸至，精气溢泻，阴阳和，故能有子;三八肾气平均，筋骨劲强……五八肾气衰，发堕齿槁……七八肝气衰，筋不能动，天癸竭，精少，肾藏衰，形体皆极;八八则齿发去。”指出先天禀赋不足，肾精亏虚是衰老的主要原因。肉苁蓉又名金笋、地精，为列当科植物肉苁蓉或管花肉苁蓉的干燥带鳞叶的肉质茎，性温、味甘咸，为补肾阳、益精血之要药，且补而不峻，有“沙漠人参”的美誉,《中华人民共和国药典》2010年版收录的肉苁蓉和管花肉苁蓉为正品药材卩或。现代药理研究证实，肉苁蓉有一定的抗衰老作用⑼。CDP是肉苁蓉的主要有效成分之一,具有免疫调节、抗衰老、改善脾虚、抗病毒、抗肿瘤及促进造血等多方面的药理作用'刃。本研究采用D-半乳糖制备衰老小鼠模型，并予CDP干预，发现CDP还具有抗衰老小鼠疲劳的作用。

在一定时间内连续注射D-半乳糖，使机体细胞内半乳糖浓度增高，在醛糖还原酶催化下，还原成半乳糖醇和双氧水(H202)o半乳糖醇不能被进一步代谢而堆积在细胞内，影响正常渗透压,使细胞渗透压升高，脆性增加、肿胀，细胞损伤，代谢紊乱;珏。2导致胞内氧化应激增加，氧自由基堆积，最终致机体衰老口们。D-半乳糖诱导衰老造模方法简便易行,价格低廉,结果稳定，已广泛用于抗衰老药物或保健品等的筛选实验研究。

评价体力疲劳的方法主要为运动耐力试验和生化指标检测。运动耐力的提高是机体抗疲劳能力增强的最直接的表现。负重游泳实验是评价药物抗疲劳作用最直接、最客观的指标，负重游泳时间越长，则表明药物的抗疲劳效果越好'⑴。本实验结果显示,模型组小鼠负重游泳时间较正常对照组明显减少(P<0.05)；而灌服CDP后，CDP低剂量组及CDP高剂量组小鼠负重游泳时间较模型组明显增加(P<0.05)o表明CDP可以提高衰老小鼠的运动耐力,具有抗疲劳的作用。

血清BUN、LA及肝糖原、肌糖原是检测疲劳最常用的生化指标。血清BUN是反映蛋白质分解代谢的主要指标,可以体现机体对运动的适应能力。研究表明，血清BUN含量随运动负荷的增加而增加,机体对负荷适应能力越差,BUN增加的就越明显「⑵。LA是糖酵解的产物，剧烈运动时,葡萄糖剧烈厌氧分解，产生大量LA,使肌肉中H+浓度上升,pH值下降，进而引起一系列的生化反应，影响机体正常代谢，从而导致机体疲劳。因此，运动后血清LA的含量能客观地反映机体无氧供能的比率，常用作无氧耐力、机体疲劳或肌肉损伤的评价指标™。本实验结果显示，模型组小鼠血清BUN及LA水平明显高于正常对照组(F<0.05)；而灌服CDP后，CDP低剂量组及CDP高剂量组小鼠血清BUN及LA水平明显降低(F<0.05)。表明CDP可以提高衰老小鼠对运动负荷及LA堆积的适应能力,恢复被LA破坏的机体内环境稳态,使机体恢复正常代谢，具有抗疲劳作用。

糖原以有氧代谢和无氧酵解的2种方式产生腺喋吟核昔三磷酸(ATP)为机体供能，即糖原转化成糖进入血液提供能量,通过无氧酵解途径直接将能量供给肌肉组织。糖原是运动时机体的主要能源物质,耐力运动时间的长短与糖原的储备量有很大的相关性，糖原储备越多,运动可持续的时间越长「⑷。糖原大量消耗后，机体则呈现出明显的疲劳状态。因此，增加体内糖原的储备量、延缓糖原减少是抗疲劳的重要途径。本实验结果显示，模型组肝糖原及肌糖原含量明显低于正常对照组(P<0.05)；与模型组相比,CDP低剂量组及CDP高剂量组肝糖原及肌糖原含量明显升高(P<0.05)。表明CDP可以增加衰老小鼠肝糖原、肌糖原含量，进而有助于提高小鼠的运动耐力时间。

衰老自由基学说认为，人类随年龄增加的退行性变化是由于自由基活性氧化损伤所致「⑸。该学说认为,机体体内具有一整套产生和清除自由基的平衡体系,而抗氧化酶活性下降、自由基物质过剩则可导致衰老。SOD和GSH-Px是机体内清除自由基的重要抗氧化酶，其活性高低反应了机体抗氧化能力。MDA是不饱和脂肪酸过氧化作用的终产物,可严重破坏细胞膜结构,细胞膜通透性增加，导致细胞肿胀、坏死。MDA含量可间接地反映细胞受自由基损害和过氧化的程度。本实验结果显示，与正常对照组相比,模型组小鼠肝组织SOD及GSH-PX活性降低(F<0.05),MDA活性升高(P<0.05)o与模型组相比,CDP低剂量组及CDP高剂量组小鼠肝组织SOD及GSH-PX活性升高(F<0.05),MDA活性降低(F<0.05)。表明CDP可以增强衰老小鼠对抗自由基损伤和抗氧化的能力，促进机体清除自由基。

综上所述,CDP低、高剂量均有抗D-半乳糖致衰老小鼠疲劳的作用。这种作用可能与降低血清BUN、LA水平，增加肝糖原、肌糖原含量，增强抗自由基损伤有关。

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