肉苁蓉含药血清诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

曾建春1，樊粤光1，刘建仁1，曾意荣1，易春智2，阎亮2

（1．广州中医药大学第一附属医院，广东广州510405；2．广州中医药大学）

【摘要】目的：研究补肾中药肉苁蓉含药血清对骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）定向分化的影响。方法：全骨髓培养法获得原代骨髓间充质干细胞，经胰酶消化传代培养至第4代，将第4代BMSCs以5×106接种于2块6孔板，每板3组孔，分为空白组、地塞米松组、肉苁蓉组，2 d后换液，加入诱导液。空白组加入含10％胎牛血清（FBS）的L－DMEM培养基继续培养，地塞米松组在基础培养基中加入诱导剂（含β甘油磷酸钠10 mmol／L，地塞米松0．1μmol／L，维生素C 50 mg／L），肉苁蓉组为含10％肉苁蓉含药血清的L－DMEM培养基。第10天取出1块6孔板做ALKP染色，另一6孔板于第20天做6孔板茜素红染色。结果：第10天肉苁蓉组及地塞米松组ALKP染色阳性，第12天可见白色钙结节，第20天茜素红染色阳性。结论：BMSCs在肉苁蓉含药血清诱导下可向成骨细胞分化，分别作为组织工程的种子细胞和诱导因子对治疗骨质疏松、骨折不愈合将有良好的前景。

【关键词】肉苁蓉；骨髓；间质干细胞；成骨细胞；细胞分化

DOI：10．3969／j．issn．1003－0034．2010．08．015

间充质干细胞（MSCs）是一种多潜能成体干细胞，主要存在于骨髓，还存在于胚胎时期间充质来源的骨外组织，如皮肤成纤维细胞、脂肪干细胞、骨骼肌的卫星细胞和血管内皮细胞等。骨髓MSCs（BM-SCs）是骨髓基质的组成成分，体外分离培养后，在一定的诱导条件下，具有向成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞等多向分化的能力。在骨组织工程的种子细胞来源主要有成骨细胞和BMSCs等。成骨细胞虽然具有良好成骨活性，但来源有限，大量分离获取困难，体外大量扩增的潜力不足，难以满足骨组织工程临床应用的需要；BMSCs不仅具有良好的成骨细胞分化潜能和高成骨活性，而且具有强大的增殖潜能，来源方便，可以满足自体组织工程，成为研究的重点。

中医认为，肾主骨、生髓。现代药理研究表明补肾药物均有不同程度的兴奋垂体－肾上腺－性腺系统作用，与骨代谢密切相关，雌激素有增强成骨作用，雄激素有促进蛋白质合成，促进骨基质增加及钙磷沉积的作用。肉苁蓉（Herba Cistanches）中苯乙醇总甙、麦角甾苷、甜菜碱均具有雄激素样作用，本实验拟研究补肾中药肉苁蓉含药血清对BMSCs向成骨细胞分化的影响。

1材料与试剂

1．1材料

1．1．1实验动物SPF无特定病原体动物（SPF）级SD大鼠50只，体重150～200 g，雌雄不限，由广州中医药大学实验中心提供。

1．1．2器材75 cm2培养瓶，96孔板，6孔板（Con-ing），酶标仪（Thermo），CO2培养箱（Heraeus），注射器针头滤器，0．22μm滤膜（MILLIpore），SIGMA－3K15离心机（sigma）。

1．2试剂L－DMEM培养基，南美洲胎牛血清

（FBS，海克隆），β甘油磷酸钠，地塞米松，维生素C，茜素红，MTT（广州威佳），DMSO（sigma），肉苁蓉（产地云南），碱性磷酸酶（ALKP）染液（南京建成生物有限公司），0．25％胰酶（GIBCO公司）。

1．3肉苁蓉含药血清的制备与分组方法

1．3．1肉苁蓉含药血清的制备取肉苁蓉药材粗粉150 g，加入70％乙醇10倍量，加热回流2次，每次1 h，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至300 ml，室温冷却，4℃冰箱保存备用。将中药药液稀释至每毫升0．3 g生药灌胃SD大鼠，共50只，每次1 ml，每日2次，连续给药4 d，最后一次给药后1 h经腹主动脉采血，室温静置3 h后置4℃冰箱过夜，2 500 r／min离心20 min，收集上清液，针头滤器过滤除菌，置于－20℃保存备用。

1．3．2分组方法本实验分3组，分别为空白组、地塞米松组和肉苁蓉含药血清组。空白组采用含10％FBS的L－DMEM培养基培养；地塞米松组，在空白组基础上加入诱导剂，其最终浓度分别为β甘油磷酸钠10 mmol／L，地塞米松0．1μmol／L，维生素C 50 mg／L；肉苁蓉组，采用10％肉苁蓉含药血清的

L－DMEM培养基培养。

1．4 BMSCs培养与观测方法

1．4．1原代BMSCs的分离培养与扩增SD大鼠经腹腔10％水合氯醛0．7 ml麻醉后，75％乙醇浸泡颈部以下躯体5 min，无菌条件下取出双下肢股骨和胫骨，修洁软组织后，咬骨钳修剪骨端，暴露髓腔。10 ml注射器吸取含10％胎牛血清的L－DMEM培养基反复冲洗髓腔，至到骨质外观微微透亮。75 cm2培养瓶收集骨髓冲洗液，放37℃、5％CO2孵育箱培养。每3 d换液1次。当细胞长满瓶底90％后，0．25％胰酶消化后，以1∶3比例传代。

1．4．2 BMSCs诱导分化取P4细胞，当细胞长满90％后，0．25％胰酶消化制备细胞悬液，以细胞密度5×106接种于2块6孔板，每板3组孔，每孔2 ml。当细胞长满瓶底80％以上后换液，空白组原培养基继续培养，地塞米松组与肉苁蓉组分别加入成骨诱导液。

1．4．3碱性磷酸酶染色诱导培养第10天时取出1块6孔板，吸去培养基，PBS清洗2遍，加入固定液固定10 min后，加入底物，37℃水浴15 min，水洗。再加入苏木素复染10 min，水洗，晾干，镜下观察。

1.4．4茜素红染色诱导培养第20天取出1块6孔板，吸去培养基，PBS清洗3次，95％乙醇固定10 min，加入0．1％茜素红－Tris－Hcl（pH 8．3）37℃，30 min，镜下观察结果。

2结果

2.1细胞形态学观察BMSCs为成纤维样细胞，贴壁后成梭形（见图1）。加入诱导液后，空白组细胞无明显变化；地塞米松组第5天开始出现细胞成聚集生长，细胞体积增大（见图2）；肉苁蓉含药血清组从第3天开始出现细胞成聚集生长，细胞体积增大（见图3）。12 d后地塞米松组（见图4）和肉苁蓉组（见图5）见明显结节形成。

3讨论

3.1肉苁蓉含药血清对BMSCs诱导作用肉苁蓉具有补中、入肝、滋肾、壮阳、润肠、通便之功效。现代药理研究表明补肾药物均有不同程度的兴奋垂体－肾上腺－性腺系统作用，与骨代谢密切相关，雌激素有增强成骨作用，雄激素有促进蛋白质合成，促进骨基质增加及钙磷沉积的作用［1］。肉苁蓉中苯乙醇总甙、麦角甾苷、甜菜碱均具有雄激素样作用。本实验发现，肉苁蓉含药血清可诱导BMSCs向成骨细胞分化。尽管目前以单味中药或复方中药诱导BMSCs向成骨细胞分化取得成功，但具体分子机制目前还未见相关报道。通过蛋白质组学研究可以分析此过程中相关蛋白质组差异，建立功能蛋白质组学，以期对肾主骨的理论进行新的诠释。

3．2细胞密度在BMSCs向成骨细胞分化过程中起着重要作用骨结节的形成除需要成骨诱导剂作用外，还有赖于接种细胞的密度，细胞密度必须达到一定的密度，细胞融合，才能向成骨细胞分化。本实验中当第4代细胞增殖至90％以上融合时加入诱导剂进行培养，当细胞密度过低时细胞将增殖缓慢，无聚集生长之趋势。在细胞密度不均匀的同一培养孔内，细胞密集区出现了细胞界限不清、结构模糊现象，细胞聚集成团状，AKP染色及茜素红染色阳性；而在细胞密度较低的区域并无细胞聚集成团状，AKP染色及茜素红染色阴性。故骨组织工程中采用微载体结合更有效的体外培养方式，如三维培养（RCCS），以获得更多的细胞对细胞移植的成功具有重大影响。

3．3肉苁蓉含药血清诱导BMSCs的临床意义骨组织工程学具有广阔的临床应用前景，成为现代骨科学的研究热点。BMSCs作为目前最为理想的骨组织工程种子细胞，对其作用研究的中心任务则是如何使之在尽可能简单的条件下定向分化为成骨细胞，进而转化为成熟的骨细胞。

目前对BMSCs定向分化常用的诱导剂由地塞米松、维生素C、β甘油磷酸钠组成。而在体外培养中，地塞米松对细胞增殖具有抑制作用［2］，与本实验所见相同，临床上地塞米松具有引起感染、骨坏死、骨质疏松等不良反应，将会限制BMSCs移植后在体内作为诱导剂的应用。肉苁蓉具有补肾、强筋骨的作用，本实验发现肉苁蓉具有促进BMSCs增殖和诱导BMSCs向成骨分化的作用。长期的临床应用中，未见肉苁蓉的不良反应，将其作为体内诱导剂具有广泛的临床应用前景。

总之，目前对于BMSCs作为骨组织工程种子细胞的研究，大多还处于实验阶段，如何能在较短时间内得到足够的BMSCs，并运用简单的方法诱导其向成骨分化，是目前研究的重点。尽管具有补肾、强筋骨作用的肉苁蓉诱导BMSCs成骨分化的机制尚有待进一步研究，但将其作为BMSCs分化诱导剂，用于MSCs移植治疗骨折延迟愈合、不愈合、骨坏死等具有光明的前景。