肉苁蓉治疗骨质疏松作用机制的网络药理学研究

王延涛1＊，杨智华2，陈怡3，麦喆钘2，黄嘉华3，孙治中3，周驰4，李伟宽

（1 1.广州市番禺区中医院综合科，广州511400；2.广州中医药大学第二临床医学院，广州510405；3.广州中医药大学第一临床医学院，广州510405；4.广州中医药大学第一附属医院保髋病区，广州510115）

中图分类号R932；R966文献标志码A文章编号1001-0408（2019）05-0645-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.05.14

摘要目的：采用网络药理学方法研究肉苁蓉治疗骨质疏松的作用机制。方法：通过检索中药系统药理学分析平台（TCMSP）获取肉苁蓉的活性成分，采用反向分子对接服务器DRAR-CPI及相关数据库GeneCards、OMIM筛选肉苁蓉活性成分治疗骨质疏松的作用靶标；采用软件Cytoscape构建肉苁蓉的“成分-靶标”网络，结合数据库String和Cytoscape绘制靶标间相互作用关系；通过服务器Systems Dock WebSite将靶标与活性成分进行分子对接评估二者间的结合活性以进行验证；最后再利用数据库DAVID对靶标基因进行基因本体分类富集分析与京都基因与基因组百科全书通路富集分析。结果：从肉苁蓉中筛选出的活性成分有13个，主要为毛蕊花糖苷、益母草碱、京尼平酸等；活性成分作用的潜在靶标有43个，主要有成骨分化特异性转录分子2（RUNX2）、血管内皮生长因子（VEGF）、白细胞介素6（IL-6）、骨生长蛋白因子（BGP）、肿瘤坏死因子（TNF）等；靶标作用涉及的信号通路有多条，主要为WNT（Wingless/Integrated）、VEGF、TNF等。结论：本研究初步探讨并验证了肉苁蓉治疗骨质疏松的主要靶标和通路，为后续进一步研究其作用机制奠定了基础。

关键词肉苁蓉；骨质疏松；网络药理学；活性成分；靶标；分子对接；信号通路

骨质疏松（Osteoporosis，OP）是一种好发于中老年人的系统性、慢性疾病，以骨密度下降和骨的显微结构破坏为主要特征。因患者的骨质脆性增加，其发生骨折的风险大大增加，轻微的外伤即可导致骨折[1-2]。骨质疏松及其严重的并发症，给患者及其家庭和社会带来了沉重的经济负担，同时也严重地影响着患者的生活质量[3]。据统计，我国老年人口总数已占总人口数的13.26％[4]。因此，探究疗效更好、更安全的治疗骨质疏松的方法显得非常必要。目前对于骨质疏松的治疗主要采取药物治疗，包括以化学药为主的骨吸收抑制药、骨形成制剂、钙剂和维生素D等[5]。另外，中医药治疗骨质疏松的报道也较多，其中尤以肉苁蓉为主要组方药材[6-9]。

肉苁蓉味甘、咸，性温，归肾、大肠经，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效，常常用于治疗由肾阳亏虚、精血不足所引起的病证[10]。近来，也有动物实验表明其对阿尔茨海默病模型大鼠有保护作用[11]。现代药理研究结果表明，肉苁蓉可以提高骨质疏松模型大鼠血清碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素及钙离子水平，促进大鼠成骨细胞骨形成蛋白2（BMP2）的表达，加快骨髓间充质干细胞的增殖，促使大鼠成骨细胞合成ALP等，从而达到治疗骨质疏松的作用[12-14]。但目前对于肉苁蓉治疗骨质疏松的作用机制研究尚停留在单项的细胞试验与动物实验上，难以详细地探究其更全面的作用机制。

网络药理学以生物信息学、系统生物学、多向药理学、计算机科学等多个学科的技术和知识为基础，可多层次、全面地阐明药物治疗疾病的作用机制，使研究更能体现整体性和系统性[15]。由于网络药理学强调从多靶标、多途径进行分析，这与中药及其复方中多成分、多靶标治疗疾病的特点不谋而合[16]。因此，本研究采用网络药理学的方法，研究分析肉苁蓉的化学成分、作用靶标以及信号通路，并进行基因本体（Gene ontology，GO）分类富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto en-cyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，通过构建肉苁蓉治疗骨质疏松的“成分-靶标-通路”网络，从整体性角度揭示肉苁蓉多靶标、多通路的作用网络，为进一步探究其治疗骨质疏松的作用机制提供参考依据。

1资料

本研究使用的数据库及相关分析平台见表1。

2方法

2.1化学成分的获取与活性成分的筛选

于TCMSP中以“肉苁蓉”作为关键词，搜索获取肉苁蓉所含的所有化学成分信息。以口服利用度（OB）大于30％、类药性（DL）大于0.18作为限定条件[17]，筛选同时符合上述2个条件的成分作为活性成分。利用Pub-chem检索上述活性成分，得到各成分的3D结构并以mol2格式保存。

2.2活性成分作用靶标及骨质疏松作用靶标的获取

4讨论

4.1肉苁蓉治疗骨质疏松的文献来源

肉苁蓉是寄生在沙漠树木梭梭根部的列当科寄生植物，具有补肾阳、益精血、润肠通便之功效[24]。《神农本草经辑注》[25]中提到肉苁蓉“主五劳七伤，补中，除茎中寒热痛，养五脏，强阴，益精气，妇人症瘕”；相关研究表明[26]，肉苁蓉可降低相关因子的阳性表达，具有一定的抗骨质疏松作用，但与其相关的机制仍待研究。因此，研究肉苁蓉抗骨质疏松的分子作用机制有较大的意义。

4.2主要活性成分分析

本次研究收集到肉苁蓉中具有抗骨质疏松的化学成分主要有毛蕊花糖苷、益母草碱、京尼平酸等。研究表明，肉苁蓉中的毛蕊花糖苷可以作为抗再吸收剂，通过阻断破骨细胞活化来减少骨质流失[27]。肉苁蓉中的益母草苷碱可通过抑制NF-κB和磷脂酰肌醇三激酶（PI3K）/丝氨酸/苏氨酸激酶（Akt）信号通路抑制破骨细胞生成并预防与雌激素缺乏相关的骨质疏松症[28]。京尼平酸参与激活成骨细胞促进骨生成的相关步骤，并抑制破骨细胞活性以抑制骨质溶解[29]。

4.3主要靶标分析

本次研究发现，肉苁蓉可通过对BGP、TNF、CTGF、PPAR-γ等靶标进行作用来达到抗骨质疏松的作用。多项研究显示，BGP可影响骨代谢、促进骨吸收，从而对骨质疏松的发生产生影响[30]；TNF-α通过激活PI3K/Akt信号传导而协同促进RANK配体（RANKL）诱导的破骨细胞形成。此外，CTGF表达的下降可促进人骨成形蛋白2（BMP-2）诱导的成骨细胞分化，CTGF的表达与调节成骨细胞分化有密切关系[31]。PPAR-γ作为PPAR基因家族的转录因子，与PPAR-β/δ不同，其可减少骨保护素（OPG）的表达和成骨细胞介导的增加破骨细胞生成等作用[32]。结合本研究结果，推测肉苁蓉可能通过提高体内TNF、BGP、ALP的水平或上调CTGF、PPAR-γ的表达来发挥抗骨质疏松作用。

4.4主要通路分析

本次研究结果显示，与肉苁蓉治疗骨质疏松相关的通路有WNT、VEGF、IL-6等。其中，WNT通路的表达可增加成骨细胞的成骨活性和矿化能力[33]，且另有相关的基础研究证实[34]，WNT可促进β-连环蛋白结合Lef1/Tcf转录因子，并改变基因表达以促进成骨细胞的扩增和功能。间充质干细胞中VEGF的表达升高会导致成骨细胞增加和脂肪细胞分化的减少，并调节二者之间的均衡比例[35]。RUNX2是成骨细胞分化和骨形成的关键调节通路，对MSCs成骨细胞谱系有着重大的作用[36]。而IL-6的表达可诱导破骨细胞活化、增强破骨细胞活性[37]，可显著促进人成骨细胞、内皮细胞和单核细胞的增殖，以及人内皮细胞的迁移[38]。

综上，本研究通过网络药理学的研究方法，分析肉苁蓉在抗骨质疏松治疗方面的有效活性成分和分子机制，结果显示肉苁蓉中具有治疗骨质疏松作用的化学成分可能是毛蕊花糖苷、益母草碱、京尼平酸等。此成分可能通过BGP、TNF、CTGF、PPAR-γ等靶标及WNT、VEGF、IL-6等信号通路发挥活性作用。另外，通过相关网络图的构建，可直观地显示出肉苁蓉治疗骨质疏松具有多成分、多途径共同作用的特点，符合中医药治疗疾病的特色，相比化学药的单基因-单靶点的作用机制，更有优势。且本研究通过分子对接验证了网络药理学数据的可靠性，但需要注意的是，本研究结果只是一种分子机制上的预测探讨，药物具体作用机制的确认仍需通过进一步的实验来验证。

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