肉苁蓉总苷对原代培养小鼠肝细胞酒精损伤保护作用研究
肉苁蓉总苷对原代培养小鼠肝细胞酒精损伤保护作用研究
罗慧英,刘渊,杨焕
甘肃中医学院药理教研室,甘肃省中药药理与毒理重点实验室,兰州730000,甘肃
摘要目的:研究肉苁蓉总苷对原代培养肝细胞的保护作用。方法:采用原位灌流法收集原代肝细胞,M T T法评价肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞存活率的影响;荧光显微镜技术评价肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞及细胞核形态的影响;流式细胞仪检测肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞凋亡的影响;免疫细胞化学染色法检测肉苁蓉总苷对bcl-2和c-f os表达的影响。结果:原代肝细胞经酒精损伤后,存活率降低,出现明显凋亡和坏死改变,凋亡抑制基因bcl-2减弱、促凋亡基因c-fo s表达增强。肉苁蓉总苷可明显提高细胞存活率,改善凋亡和坏死情况,增强bcl-2表达,抑制c-fo s表达。且作用呈剂量依赖性。结论:肉苁蓉总苷可通过增加凋亡抑制基因bcl-2表达,减少促凋亡基因c-fo s表达,减少凋亡和坏死,增加细胞存活率来实现对原代培养肝细胞的保护作用。
关键词 肉苁蓉总苷;原代培养;肝细胞;酒精性肝损伤;凋亡
中图分类号:R965.2 文献标识码:A 文章编号:1009-2501(2011)08-0856-06
近年来,随着人们生活水平的提高,酒精消费量快速上升,伴随而来的是各种与酒精相关的疾病的增加,酒精性肝损伤是其中一个重要的问题。研究表明肉苁蓉具有增强机体的免疫功能、抗衰老、抗辐射、抗氧化以及抗脂质过氧化和对酒精肝损伤的保护作用[1]。苷类物质是肉苁蓉的主要活性物质,在前期的实验中通过动物试验证实肉苁蓉总苷可能通过减少自由基的产生,增强对自由基及其代谢产物的清除能力,从而抑制脂质过氧化,起到对酒精性肝损伤的保护作用[2]。本实验将通过肝细胞原代培养,从细胞水平探讨肉苁蓉总苷对酒精性肝损伤的保护作用。
1材料与方法
1.1试剂及仪器肉苁蓉总苷,深褐色粉末,由
兰州大学药学院提供,含苯乙醇总苷88.6。双蒸水溶解,培养液稀释成所需浓度。酶标仪(美国贝克曼库尔特AD 340)、荧光显微镜(O lym pus,BX51)、倒置相差显微镜(Leica DMI3000B)、流式细胞分析仪(Beckman coulter cell,Cell Lab Quanta SC)等。
1.2原代肝细胞分离培养采用原位灌流法[3]。
取昆明小鼠1只,0.5戊巴比妥0.5 m L腹腔注射麻醉。常规皮肤消毒后开腹,将胃肠移向左侧,暴露门静脉,小心将输液器的输液针自门静脉远端刺入并结扎固定。将输液器的流量开至最大(约4 m L/min),滴入经37℃预热的无钙预灌流液,待肝脏肿大,迅速自下腔静脉远端切断,间歇性压迫下腔静脉近端,使肝脏交替回缩与膨大。预灌流至冲尽残血,肝脏呈均匀黄白色时,换用预温的0.05胶原酶(Sig ma)灌流液进行消化灌流。当肝脏变软无弹性,肝包膜下出现小液泡,或肝组织出现均匀裂隙时停止消化。小心游离肝脏,移至盛有适量DM EM高糖培养液(Sig ma)的无菌平皿中,剥离肝包膜并轻轻振荡,即可将肝细胞散落于培养液中,收集于锥形管内,振荡培养10 min(振频为100次/min),离心3 min(4℃,1000 r/min),弃上清。用培养液悬浮细胞,200目尼龙网过滤,滤液反复离心3次(4℃,1000 r/min),即获得肝实质细胞。调整细胞浓度为5×106个/m L后,接种于用鼠尾胶原预处理的25 mL培养瓶中,37℃、5 CO 2孵育箱静置培养,24 h后换液,弃去未贴壁细胞,继续培养,供后续试验使用。
1.3原代培养小鼠肝细胞的生长曲线的测定将分离纯化后的肝细胞调整至5×106个/m L接种于24孔板,每孔接种细胞悬液1 m L,共接种21孔,含10胎牛血清(Sigm a)的DM EM高糖培养液培养7 d。每天随机取3孔,0.25胰酶消化吹打均匀后计数板计数,并绘制生长曲线。1.4酒精肝细胞损伤模型的建立将以上述方法获得的呈对数生长的肝细胞接种于鼠尾胶原预处理的96孔板,每孔接种100μL,10胎牛血清的DM EM培养液培养24 h后换液,再培养24 h,设空白组,50、75、100、125、150 mmo l/L五个酒精干预组,每组设五个复孔。肝细胞与不同浓度的酒精培养24 h后,每孔加0.5的M TT(Si gma)20μL,再继续培养4 h,弃上清液,每孔加DM SO 150μL,置摇床混匀15 min,570 nm检测吸光度值,并计算细胞存活率。细胞存活率=给药组OD值/对照组OD值×100
1.5肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞存活率的影响将上述方法获取的肝细胞接种于鼠尾胶原预处理的96孔板,每孔接种100μL,10胎牛血清的DM EM培养液培养24 h后换液,再培养24 h后,给药组分别加入终浓度为0.2、0.4、0.8 g/L的GCs,酒精模型组和空白组不加药继续培养,每组设五个复孔。24 h后模型组和GCs干预组分别加入终浓度为100 mm ol/L的酒精,培养12 h后,M TT法测定细胞存活率。
1.6肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞及细胞核形态的影响将预先灭菌处理的盖玻片置于6孔板中,接种浓度为5×106个/m L的细胞悬液,设模型组、肉苁蓉组(0.2、0.4、0.8 g/L)和空白组,培养24 h后,加入终浓度为100 mmo l/L的酒精,培养24 h后取出载玻片95的乙醇固定15 min,PBS洗两次,重新分散于PBS中,调整细胞浓度在5×104个细胞/m L,加入10μL的丫啶橙-溴化乙啶混合液(Sig ma)(0.01μg/m L丫啶橙溶液,0.02μg/m L溴乙啶溶液,混合体积比:1/1),孵育30 min后,荧光显微镜下观察、摄像。
1.7肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞凋亡的影响
将消化好的细胞悬液密度调整为5×10个/m L,接种于六孔板中培养24 h后,设模型组、肉苁蓉组(0.2、0.4、0.8 g/L)和空白组,培养24 h后,加入终浓度为100 mmo l/L的酒精,孵育24 h,消化收集细胞,PBS洗涤2遍后,用70的预冷乙醇4℃固定过夜,PBS液洗涤两次,加入RN A酶(Sigm a),PI(100μg/m L)(Sig ma)均匀染色,放入37℃水浴30 min,流式细胞仪测定细胞凋亡率。
1.8肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞凋亡抑制基因bcl-2和促凋亡基因c-f os表达的影响取6孔培养板三张,每3孔为一组,设模型组、肉苁蓉组(0.2、0.4、0.8 g/L)和空白组,每孔置入1块无菌玻片,取对数生长期细胞,胰酶消化制备单细胞悬液,调整细胞密度为5×106/m L,接种于6孔板,2 m L/孔。培养24 h后,加入终浓度为100 m mol/L的酒精,继续培养24 h,取出爬满细胞的玻片,PBS洗2遍,常规免疫组化ABC法染色,简要步骤如下:以40多聚甲醛固定10 min,正常羊血清封闭30 min,滴加bcl-2多克隆抗体(Invit rogen)(1:75)或c-f os多克隆抗体(Invi tro-gen)(1∶50),室温反应1.5 h,加入ABC复合物室温反应2 h,DAB显色,明胶封片。光镜下观察并摄像,比较Bcl-2和c-fo s蛋白表达。
1.9统计学处理实验数据用SPSS 13.5软件处理。以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1原代培养小鼠肝细胞的生长曲线由图1可以看出随着孵育时间延长,肝细胞数不断增加,在第4天时进入对数生长期。
凋亡是一种特殊形式的细胞死亡,当细胞发生凋亡时会出现特殊的形态学和生化学的改变[6-8]。实验证实当酒精处理后大部分肝细胞细胞发生了凋亡,细胞出现了明显的形态改变,表现为:细胞变小、细胞表面微绒毛消失、细胞表面皱缩、有空泡形成、细胞核聚缩、有凋亡小体形成等;同时伴有坏死产生。肉苁蓉总苷处理后凋亡率明显下降,坏死情况也有所缓解。
bcl-2基因为原癌基因,目前已发现5个bcl-2基因家族(bcl-2、bcl-x、bax、mcl-1和A 1),其中bcl-2可抑制细胞程序性死亡(PCD)。bcl-2的作用机理可能有:(1)抑制Ca2+的释放。bcl-2是一种跨膜蛋白,其主要位于核膜上,核内外膜之间由内质网管腔相连,后者是细胞内Ca2+的主要贮存场所,而Ca2+在细胞凋亡过程中起重要作用。应用转基因方法发现bcl-2高表达可抑制内质网释放Ca2+,故推测bcl-2对细胞凋亡的抑制作用可能与细胞内质网中Ca2+有关[9]。(2)bcl-2通过阻止促凋亡基因信号传递,或阻止这些诱导基因产物而发挥抗细胞凋亡作用。研究表明bcl-2蛋白可抑制P53、c-fo s诱导的细胞凋亡等[10]。(3)bcl-2可通过抑制自由基而发挥抗凋亡作用,bcl-2具有抗氧化剂作用,它可抑制超氧化物的产生和作用,从而抑制细胞凋亡的发生[11]。
早期即刻基因(IEG s)是一种在各种有害刺激条件下出现早的、持续时间短的基因,c-f os是其中的一种原癌基因,位于染色体14q21-q31,是一段9 kb的DNA,由四个外显子和三个内含子组成[12],基础转录较低,但可以被各种不同的第二信使分子引发快速而短暂地表达。c-f os的蛋白产物是FOS,原癌基因c-Jun编码的蛋白是JUN,FOS含有一个亮氨酸抗链(leucinezipper LZ),FOS与JUN在细胞核内通过LZ结构形成异二聚体,称为转录因子AP-1,结合于靶基因的AP-1位点,作核的第三信使,能使效应基因较长时间的表达[14]。M organ认为c-f os的不同表达形式提示了其功能的多样性和复杂性。暂时一过性表达可能参与了细胞的保护修复及重塑再生,而持续过度表达与继发性损害有关。并认为二者的表达机制不一样。因此可以认为c-fo s等IEG s起到双重作用。当修复防御系统完全被抑制时,它们参与凋亡;未被抑制时则对病灶周围的细胞有保护作用,参与细胞的修复及再生过程[15]。Webster KR用反义核苷酸降低c-fo s的转录而阻止凋亡发生,表明c-fo s过度表达与细胞凋亡有必然联系,与多种疾病的发生、发展有关[16]。
在本实验中,肝细胞经酒精损伤后,凋亡抑制因子bcl-2表达明显减弱,c-fo s表达增强,提示肉苁蓉总苷可能通过增强bcl-2表达,抑制c-fo s表达,减少肝细胞损伤与凋亡,实现对肝细胞的保护作用。
参考文献（不完全展示）
[1]Q uanbo X,Shig etoshi K,T adato T,e t al.A ntioxi-dativ e effec ts of pheny le thanoids fro m Cistanche de-ser ticola[J].Biol Pharm Bull,1996,19(12):1580-1585.
[2]罗慧英,刘渊,席国柱,等.肉苁蓉总苷对小鼠酒精性肝损伤的保护作用[J].中国临床药理学与治疗学,2009,14(11):1225-1228.
[3]van de Lo osdrecht A A,Beelen RH,O ssenkoppele GJ,e t al.A tetr azo lium based co lo rime tric M T T assay to quantitate human mo no cy te media ted cy to-toxicity ag ainst leukemic cells fro m cell lines and pa-tients w ith acute my eloid leukemia[J].J Immunol M ethods,1994,174(1/2):311-320.