摘 要：目的 基于网络药理学方法探讨肉苁蓉-巴戟天药治疗股骨头坏死的作用机制。方法 通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）对肉苁蓉-巴戟天药对中活性成分进行筛选，通过 GeneCards、OMIM数据库检索股骨头坏死疾病靶点，取得交集基因后使用Cytoscape 3.7.1建立化合物-疾病-靶点调控网络，基于生物学信息注释数据库（DAVID）对核心靶点进行基因本体（GO）功能富集分析与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果 共得到肉苁蓉-巴戟天药对的21个活性成分和182个潜在靶点，相关的疾病靶点 727个，GO富集分析主要包括细胞凋亡、脂质代谢异常、活性氧反应等功能途径；KEGG通路分析主要包括缺氧诱导因子-1信号通路、p53信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等。结论 基于网络药理学初步揭示出肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死多成分、多靶点、多通路的整体调节作用，其作用机制可能与脂质代谢异常、细胞凋亡、缺氧诱导因子-1信号通路、p53信号通路密切相关。

关键词：网络药理学 股骨头坏死 肉苁蓉 巴戟天

股骨头坏死是由于股骨头血供中断或持续性受损，进而引发股骨头结构改变、功能障碍的一种骨科关节疾病。流行病学结果显示，我国约有 500-700 万例股骨头坏死患者，且新患病率呈逐年升高趋势^[1-2]。由于股骨头坏死发病机制尚未完全阐明且呈慢性进行性发展，若不能早期发现、早期治疗，会严重影响患者生活质量，这是目前亟待解决的医学难题。随着疾病治疗模式转变，中医药对于股骨头坏死治疗作用体现在改善血流变学状态与股骨头结构、促进微血管修复与再生、降低血脂等方面，在股骨头坏死防治中应用较广且临床效果显著^[3]。肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉的干燥带鳞叶的肉质茎，其味甘、咸，性温，归肾、大肠经，临床可发挥补益肾阳、填精益髓、润肠通便的作用；巴戟天为茜草科巴戟天的干燥根茎，其味甘、辛，性微温，归肾、肝经，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿之功效^[4]。有研究显示，肉苁蓉-巴戟天药对用于治疗股骨头坏死疗效确切[5]，但由于中药成分的复杂性，其作用机制尚不完全明确。基于网络药理学可通过对中药复方的活性成分进行鉴定，寻找目标靶点，与疾病进行网络构建，与中药多成分，多靶点的作用途径具有一致性^[6-7]。我们基于网络药理学探讨肉苁蓉-巴戟天药治疗股骨头坏死的作用机制，意在从分子学角度揭示肉苁蓉-巴戟天治疗股骨头坏死的作用机制，为中医药治疗股骨头坏死提供研究方向以及科学依据。

表1 数据库及分析平台

表2 肉苁蓉-巴戟天药对活性成分基本信息

1 材料与方法

1.1 数据库及分析平台

数据库及分析平台详见表1。

1.2 肉苁蓉-巴戟天药对中活性成分筛选及靶点预测

通 过 中 药 系 统 药 理 学 数 据 库 与 分 析 平 台（TCMSP），筛选条件为类药性（DL）≥0.18、口服生物利用度（OB）≥30%，对肉苁蓉、巴戟天的活性成分进行初步筛选，并对筛选出的活性成分进行靶点预测，通过PubMed、CNKI数据库利用文献查询的方式进行补充。利用Chemical Book、爱化学数据库对所得化学成分名称进行量化，利用UniProt数据库对筛选靶蛋白名进行标准化。

图1 肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死核心靶点韦恩图

图2 肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死核心靶点PPI网络图

1.3 股骨头坏死疾病靶点的获取

以“osteonecrosis of the femoral head”作为关键词，检索数据库包括GeneCards、OMIM数据库。

1.4 核心靶点筛选及PPI网络构建

将肉苁蓉-巴戟天药对与股骨头坏死靶点进行映射，利用韦恩图的方式取得交集进而筛选核心靶点。利用 STRING 数据库在线平台构建核心靶点的蛋白蛋白相互作用（PPI）网络，将研究物种设置为人、互作分数值设置为 0.400。建立调控网络以便将肉苁蓉巴戟天药对股骨头坏死的作用机制立体化呈现。

1.5 核心靶点的GO富集分析、KEGG通路分析

为进一步说明核心靶点蛋白在基因功能中的作用，通过 DAVID 数据库对核心靶点 GO 富集分析、KEGG通路分析，物种限定为人类，阈值设定为PValue＜0.05，同时利用 OmicShare 云平台完成数据结果可视化。

2 结果

2.1 肉苁蓉-巴戟天药对活性成分筛选和靶点预测

根据 DL、OB 参数对 TCMSP 进行筛选，共得到肉苁蓉-巴戟天药对的活性成分 25个，排除未获得对应靶点的 4 个有效成分，最终获得活性成分 21 个，有效成分对应的靶点 182 个，具体成分及靶点信息结果见表2。

2.2 股骨头坏死疾病靶点建立

通过检索 GeneCards检出与股骨头坏死相关的已知靶点 277 个、通过 OMIM 数据库检出与股骨头坏死相关的已知靶点 453 个，经过处理后共获得 727 个相关靶点纳入研究。

2.3 肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死的核心靶点筛选以及网络互作关系构建

利用韦恩图在线平台将727个股骨头坏死疾病靶点与 182个肉苁蓉-巴戟天药对活性成分作用靶点映射以绘制韦恩图，依据交集基因结果，获得肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死的核心靶点33个（图1）。将33个核心靶点导入STRING数据库在线平台，构建PPI网络模型，导出核心靶点的PPI网络数据（图2）。利用 Cytoscape 3.7.1 构建调控网络（图 3）。网络中共包含 54 个节点、62 条边。在有效成分方面，MOL000098（槲皮素）作用靶点为 30 个，MOL000358（β-谷甾醇）作用靶点为 6个。在核心靶点方面，类固醇受体激活蛋白 2（NCOA2）能与 13 个有效成分相连接，钙激活钾通道蛋白 α1（KCNMA1）能与 4 个有效成分相连接。由此体现出肉苁蓉-巴戟天药对多成分、多靶点治疗股骨头坏死的作用机制。

2.4 肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死中核心靶点GO富集分析

通过 GO 富集分析，共计获得生物过程（BP）相关条目 210个、分子功能（MF）相关条目 34个、细胞组成（CC）相关条目 20个（图 4~图 7）。结果显示，肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死的生物过程主要富集脂质反应，活性氧反应，细胞凋亡等方面；分子功能主要富集于细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶及生长因子活性，转录因子、生长因子受体、核激素受体及过渡金属离子结合能力等方面；细胞组成主要富集于膜腔及内膜系统，血小板α颗粒、分泌颗粒及分泌小泡，细胞外基质等方面。

2.5 肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死中靶点基因KEGG通路分析

通过 KEGG 通路分析，共计获得 KEGG 条目 67个（图8-图9）。结果显示，肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死的生物学通路主要涉及 p53 信号通路、缺氧诱导因子-1 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、白细胞介素-17信号通路等。

3 讨论

图3 肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死的化合物-疾病-靶点调控网络图

图4 肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死的GO功能富集分析柱状图

肾为先天之本，主骨生髓，肾精充足则骨髓生化有源而强劲有力，肾精亏虚则骨髓生化乏源，骨骼疏松无力，因此股骨头坏死治疗早中期应以补肾强骨为主要的治疗原则，组方多以肉苁蓉、巴戟天、淫羊藿等补肾填精中药为主^[8]。基于组学技术特征性指标、相关理化检查指标、影像学技术指标以及非编码RNA技术指标在股骨头坏死中医辨证客观化中的量化应用，能够更为有效的探讨股骨头坏死中医分型的致病特点^[9]。通过网络药理学能够全面揭示中药复方治疗股骨头坏死的潜在机制，通过构建“化合物-疾病-靶点”调控网络全面分析中药复方有效成分作用于疾病靶点，为研究中药复方作用机制及中药新药开发提供理论和技术支持^[10-11]。肉苁蓉-巴戟天药对是中医补肾强骨的常用药对，两者相须为用，协同增效。本研究通过初步筛选得到 21 个肉苁蓉-巴戟天药对有效成分，筛选得到 33个肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死的核心靶点，化合物-疾病-靶点调控网络表明肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死作用机制复杂多样且靶点众多，非单一靶点作用而成。因此肉苁蓉-巴戟天药对的有效成分之间协同作用紧密，且作用靶点在股骨头坏死治疗过程中发挥重要作用^[12-14]。

肉苁蓉-巴戟天药对有效成分分析显示，槲皮素具有免疫抑制、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多种药理作用，可通过调控成骨细胞/破骨细胞平衡、抑制细胞外基质降解以及促炎性因子表达、影响炎症信号通路等方面而起到骨关节保护作用^[15]；β-谷甾醇具有抗炎、抗血小板聚集、降血脂、免疫抑制等多种药理作用，可通过刺激卵巢颗粒细胞分化、促进成骨细胞增殖而起到骨代谢调控作用^[16]。肉苁蓉-巴戟天药对靶点分析显示，KCNMA1能够同时受到膜电压和细胞内钙离子双重调节，在人体骨肉瘤细胞和成骨前体细胞中广泛表达，通过敲除基因发现其能够明显抑制骨髓间充质干细胞的细胞增殖和成骨分化现象^[17]；肿瘤坏死因子α、白细胞介素-10、白细胞介素-6在股骨头坏死患者机体内显著升高，与股骨头坏死疾病遗传易感性密切相 关 ，肿 瘤 坏 死 因 子 - α 基 因 多 态 性 rs1800629、rs1800630，白细胞介素-10基因多态性rs1800872与股骨头坏死发生显著相关^[18-19]；糖皮质激素引起的缺氧诱导因子-1α抑制在股骨头坏死发病及发展过程中发挥重要作用^[20]；转化生长因子β1可诱导血管内皮生长因子过度分泌一方面引起骨组织纤维化以阻止骨组织修复^[21]，另一方面诱导未分化的间充质细胞向纤维细胞分化以降低骨密度^[22]。

图5 肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死的GO功能富集分析-BP分析气泡图

图6 肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死的GO功能富集分析-MF分析气泡图

图7 肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死的GO功能富集分析-CC分析气泡图

GO富集分析显示，肉苁蓉-巴戟天药对主要通过脂质代谢、细胞凋亡、细胞因子表达、活性氧反应而发挥股骨头坏死治疗作用。①细胞凋亡：成骨细胞大量凋亡可导致骨量减少，骨小梁变细、数量减少以及骨皮质多孔、变薄等骨微结构变化的表现，这些病理过程逐步积累，影响股骨头的正常血液供应，最终引起股骨头缺血坏死，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶磷酸化、p53基因均为参与骨细胞凋亡的关键因素^[23]。张飞等^[24]研究显示，肿瘤蛋白 p53 和帕金森相关蛋白通过调节线粒体自噬可有效抵抗骨髓间充质干细胞应激性凋亡和细胞衰老，提高骨髓间充质干细胞对早期激素性股骨头坏死修复作用。研究表明，巴戟天多糖，巴戟天的活性提取物，可通过刺激骨髓基质细胞向成骨细胞分化以调节骨代谢平衡^[25]。②细胞因子表达：胰岛素样生长因子、骨形态发生蛋白、血管内皮生长因子、前列腺素 E2、血小板衍生生长因子、转化生长因子 β 等多种生长因子可通过促进股骨头血管生成、增强骨与软骨增殖分化从而发挥股骨头坏死治疗作用^[26]。此外，糖皮质激素、雄激素、雌激素、维生素 D 等核激素受体及Runt相关转录因子、叉头框转录因子O等转录因子受体亦参与股骨头坏死形成发展。研究证实，肉苁蓉含药血清可促进骨形态发生蛋白2表达定向分化成骨细胞^[27]。③脂质代谢：脂质沉积可阻碍骨内微循环平衡及修复，激活或抑制成骨、成脂细胞转录造成脂肪代谢紊乱最终导致股骨头坏死^[28]。陈彦同等^[29]研究发现，氧化还原反应平衡失调则可导致脂质过氧化导致成骨细胞功能紊乱、分化障碍和凋亡，脂质代谢紊乱引起的非创伤性股骨头坏死与过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路、钙离子相关信号通路、腺苷酸活化蛋白激酶信号通路密切相关。④活性氧反应：活性氧增高可通过促进血管内皮损伤、减少骨细胞与成骨细胞、异常激活破骨细胞、促进软骨胶原纤维与蛋白聚糖降解，导致股骨头血供障碍、机械支撑结构受 损 、受 力 区 股 骨 头 变 平 塌 陷 ，最 终 造 成 股 骨 头坏死^[30]。

图8 肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死的KEGG通路富集分析柱状图

图9 肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死的KEGG通路富集分析气泡图

KEGG通路分析显示，肉苁蓉-巴戟天药对主要通过 p53信号通路、白细胞介素-17信号通路、缺氧诱导因子-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等多条信号通路而发挥股骨头坏死治疗作用。①p53 信号通路：p53作为肿瘤抑制因子，可通过调控内源性凋亡途径、死亡信号受体蛋白途径、线粒体释放氧自由基以诱导细胞凋亡，能够被活性氧集团簇、DNA损伤、缺氧环境等因素激活，p53 信号通路可调控细胞凋亡及细胞周期在股骨头坏死中发挥重要作用。研究表明股骨头坏死区可出现 p53 表达增高现象^[31]。②缺氧诱导因子-1信号通路：缺氧诱导因子-1信号通路在机体对低氧浓度或缺氧应答中至关重要，股骨头坏死低氧环境可影响破骨细胞生成，缺氧诱导因子-1信号通路能够耦连血管生成、骨吸收和新骨形成个 3 生物过程从而发挥治疗作用。研究发现，缺氧诱导因子-1α 可通过介导血管内皮生长因子参与血管生成过程、同时可发挥调节营养物质传输、影响破骨细胞功能，进而造成股骨头坏死骨吸收障碍^[32]。③肿瘤坏死因子信号通路：肿瘤坏死因子通过与其受体结合在股骨头坏死中发挥作用。研究显示，血清肿瘤坏死因子-α的表达在激素性股骨头坏死兔模型组中明显升高^[33]，肿瘤坏死因子-α 基因多态性和缺氧环境则可显著影响激素诱导性股骨头坏死临床的发生发展^[34]。肿瘤坏死因子-α 作为临床最常见的炎症因子，在股骨头血管内皮细胞受损中发挥重要作用，亦可以通过血管内凝血进而影响股骨头血供；还可引起骨细胞、软骨细胞吸收障碍，促使成纤维细胞增生；亦可诱导氧自由基产生、脂质过氧化反应、成骨细胞凋亡等病理过程，上述环节相互作用最终导致股骨头坏死的发生^[35]。

综上所述，肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死具有活性成分多，作用靶点多样、作用途径广泛的特点，涉及生物学通路包括 p53 信号通路、缺氧诱导因子-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、白细胞介素-17 信号通路等，生物学过程包括细胞凋亡、细胞因子表达、脂质代谢、活性氧反应等功能途径，此研究结果为后续针对肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死的机制研究提供了科学依据以及研究方向。鉴于本文筛选条件的限制，使得研究结果具有一定的局限性。与此同时，本研究结果仅作为生物信息学中的机制预测，具体药物作用机制仍需进一步实验进行验证。

来源：郭雪峰，侯德才，于睿．基于网络药理学探讨肉苁蓉-巴戟天药对治疗股骨头坏死的作用机制[J/OL]．世界科学技术-中医药现代化.https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.5699.R.20220104.0921.004.html