管花肉苁蓉醇提取物对缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞损伤的保护作用及机制研究

王竞康，王丽超，姜勇，屠鹏飞，曾克武*

(北京大学天然药物与仿生药物国家重点实验室，北京100191)

［摘要］探究管花肉苁蓉醇提取物(CTEE)对缺氧/缺糖再灌注(OGD/Ｒ)所致的PC12细胞损伤的抑制作用及潜在机制。实验以OGD/Ｒ诱导PC12细胞作为损伤模型，通过MTT法检测细胞存活率、通过AO/EB与Hoechst 33258染色法考察细胞凋亡、通过JC-1染色法考察线粒体膜电位变化、通过MitoSOX染色法考察线粒体氧化应激反应，通过Western blot法考察凋亡相关蛋白(PAＲP，cleaved PAＲP，caspase-3，cleavd caspase-3，Bax，Bcl-2)的表达，研究了CTEE(12.5，25，50 mg·L－1)对神经细胞的保护作用。结果显示，CTEE可以有效保护OGD/Ｒ诱导的PC12细胞损伤，并提高PC12细胞存活率，AO/EB与Hoechst 33258染色法显示CTEE可以有效抑制细胞凋亡。此外，JC-1与MitoSOX染色法显示CTEE可显著降低细胞中线粒体的氧化应激及线粒体膜电位的失调，且呈剂量依赖性。同时，CTEE可明显抑制线粒体凋亡信号通路中关键蛋白caspase-3和PAＲP的激活，且明显抑制Bax的升高和Bcl-2的下调。以上结果表明，管花肉苁蓉醇提取物对OGD/Ｒ所致的PC12细胞损伤具有较好的保护作用，其潜在机制可能是通过抑制线粒体氧化应激及相关凋亡信号通路实现的。

［关键词］神经损伤;缺氧/缺糖再灌注;管花肉苁蓉;醇提取物;线粒体通路

缺血性脑中风(ischemic stroke)是现代社会威胁老年群体的重要致死性疾病，也是当前药物研发的热点领域［1-2］。脑是人体中对氧需求量最高的器官，因此脑缺血常常对脑组织造成十分严重的损伤，并引发脑死亡甚至危及生命。现代研究发现，缺血性脑中风最主要的特点是缺氧状态所诱发的神经细胞内的氧化应激反应，该过程中生成的氧自由基会损伤神经细胞内的线粒体，增加线粒体膜通透性，进而激活下游凋亡信号通路，诱导神经细胞凋亡［3-4］。此外，由于线粒体是合成细胞能量的源头，其功能受损必然会影响到神经细胞功能的发挥，并引起脑功能损伤。因此，以线粒体为靶向的神经保护剂的研发是治疗缺血性脑中风的一个关键方向［5-6］。

管花肉苁蓉Cistanche tubulosa(Schenk)Ｒ．Wight是传统中药之一，具有补肾阳、益精血、润肠通便的药理功效。现代药理学研究发现，管花肉苁蓉具有抗氧化、抗衰老、抗凋亡、抗辐射和改善学习记忆等作用［7-9］，特别是对于脑缺血再灌注有很好的保护作用，相关药品苁蓉总苷胶囊主要在临床上用于治疗轻中度血管性痴呆并得到广泛应用［10］。但是关于管花肉苁蓉治疗脑缺血和发挥神经保护的分子药理机制目前还尚不清楚，亟待揭示。因此，本研究旨在探讨管花肉苁蓉醇提取物对缺氧/缺糖再灌注所致的神经细胞损伤的保护作用，特别是探究了管花肉苁蓉发挥神经细胞保护作用的线粒体调控机制，最终为缺血性脑中风的创新药物研发提供全新候选药物及干预策略。

1材料

PC12细胞系购自中国医学科学院细胞中心。管花肉苁蓉95%乙醇提取物由北京大学中医药

现代研究中心制备;AO/EB双染色试剂盒(CA1140)购自北京索莱宝科技有限公司;Hoechst 33258染色液(C0021)购自北京索莱宝科技有限公司;线粒体膜电位染色试剂盒(JC-1)(C0026)购自南京碧云天生物技术公司;结晶紫染色液(DZ0056)购自北京雷根(Leagene)生物技术有限公司;MitoSOX染色试剂盒(S0033)购自南京碧云天生物技术公司;DMEM培养基(CM15019)购自北京中科迈晨(Macgene)科技有限公司;胎牛血清购自PAN-Biotech上海斯信生物科技有限公司(德国);溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)(Amresco0793)购自北京中科科奥公司;蛋白抗体购自Cell Signaling Technology公司(美国);Tanon-5200 Multi凝胶成像分体系统购自上海天能;Sunrise-Basic酶标仪购自TECAN公司(美国);倒置荧光显微镜(IX73)购自OLYMPUS公司(日本)。

2方法

2.1细胞培养与处理PC12细胞系用高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清，100 U·L－1青霉素，100μg·L－1链霉素)进行传代培养，每2天传代1次。

将细胞分为空白对照组，缺氧/缺糖再灌注损伤组和不同浓度药物处理组(12.5，25，50 mg·L－1)。用1体积的DMEM培养液正常培养细胞，构建缺氧/缺糖再灌注损伤模型时，用1/2体积的Earle's溶液替换原DMEM培养液，并将其置于缺氧盒中孵育4 h。造成缺氧/缺糖损伤后，往1/2体积的Ear-le's溶液中加入3/2体积的DMEM培养液，实现缺氧/缺糖再灌注损伤。

2.2 MTT法检测细胞存活率PC12细胞以1×104

个/孔接种于96孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h，弃去上清液，并加0.5 g·L－1 MTT染色，温箱孵育2 h;加入DMSO后，酶标仪检测吸光度(A570 nm)。

2.3结晶紫染色分析PC12细胞以5×104个/孔接种于24孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h，加入4%多聚甲醛固定10 min;将多聚甲醛吸走，加入PBS清洗，清洗3次;弃去PBS，加入结晶紫染液，染10 min;将染液吸走，加入PBS清洗，清洗3次，用倒置显微镜(×10)观察细胞形态。

2.4 AO/EB染色分析PC12细胞以5×104个/孔接种于24孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h，加入PBS清洗，清洗3次;弃去PBS，加入200μL AO/EB(100μL AO和100μL EB等体积混合)染液，避光，染色2 min;将染液吸走，加入PBS清洗，清洗3次，用荧光显微镜观察(×200)细胞核形态。

2.5 Hoechst 33258染色分析PC12细胞以5×104个/孔接种于24孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h。加入4%多聚甲醛固定30 min;将多聚甲醛吸走，加入PBS清洗3次;弃去PBS，加入Hoechst 33258染液染色30 min;将染液吸走，加入PBS清洗3次，每次5 min。用荧光显微镜(激发波长352 nm，发射波长461 nm)观察(×200)细胞核形态。

2.6 JC-1染色分析PC12细胞以5×104个/孔接种于24孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h，按试剂盒要求将母液配置成工作液，加入工作液，避光，染色30 min;将工作液吸走，加入PBS清洗，清洗3次，用荧光显微镜(激发波长514 nm，发射波长529 nm)观察(×200)细胞线粒体形态。

2.7 MitoSOX染色分析PC12细胞以5×104个/孔接种于24孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h，加入PBS清洗3次;弃去PBS，按试剂盒要求将母液配置成工作液，加入工作液，避光，染色20 min;将工作液吸走，加入PBS清洗3次，用荧光显微镜(激发波长488 nm，发射波长525 nm)观察(×200)细胞线粒体形态。

2.8蛋白免疫印记(Western blot)分析PC12细胞经药物处理后，用ＲIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂)裂解细胞，得到细胞总蛋白提取液。总蛋白经过定量后，用6%～12%SDS-PAGE分离，湿法转移至PVDF膜上。脱脂奶粉封闭PVDF膜后加入一抗，室温孵育2 h，充分洗涤后加入二抗，室温孵育1 h。最后加ECL显色试剂并在凝胶成像系统上拍照。

2.9统计学分析所有数据用x－±s表示，采用GraphPad Prism 5统计学软件进行t检验和单因素方差分析，P＜0.05认为有统计学意义。

3结果

3.1管花肉苁蓉醇提取物保护缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞的存活缺氧/缺糖再灌注损伤显著诱导神经细胞存活率降低，而加入管花肉苁蓉醇提取物后，有效逆转了这一过程，在12.5，25，50 mg·L－1 3个剂量下，管花肉苁蓉醇提取物对神经细胞的存活率具有显著提升作用，表明在此实验条件下，管花肉苁蓉醇提取物具有较好的抗缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞损伤作用;而管花肉苁蓉醇提取物在相同剂量条件下对神经细胞存活无明显毒性(图1)。此外，从结晶紫染色结果看，管花肉苁蓉醇提取物可以显著保护缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞形态学变化，维持细胞正常的形态(图1)，这与细胞存活率的研究结果存在一致性。

3.2管花肉苁蓉醇提取物抑制缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞的凋亡AO/EB染色分析发现，缺氧/缺糖再灌注损伤显著诱导神经细胞凋亡的发生(红色

源于中医药的脑保护剂的研发一直是人们关注的热点。管花肉苁蓉是最具代表性的神经保护剂，研究发现其对于神经细胞的过氧化损伤、脂质代谢、单胺类神经递质以及水通道蛋白等均具有较好的逆转和保护作用［13-16］。管花肉苁蓉的活性成分能否通过血脑屏障是其发挥作用的关键因素。前期研究发现，肉苁蓉的主要成分松果菊苷等可通过血脑屏障进而发挥神经保护作用，具有潜在的治疗脑缺血和脑水肿的功效［17-19］。本研究发现，管花肉苁蓉的醇提取物具有较好的抗神经细胞损伤作用，其可能是通过降低神经细胞内的线粒体氧化性损伤，进而抑制线粒体去极化水平来发挥作用的。值得一提的是，笔者发现当线粒体损伤时，其倾向于聚集成团，而管花肉苁蓉能够有效地抑制受损线粒体的成团趋势，提示管花肉苁蓉可能会在一定程度上调控线粒体的动力学过程，但是相关机制有待进一步探究。此外，作为线粒体功能密切相关的2个标志性蛋白Bcl-2和Bax的表达来看，管花肉苁蓉对Bcl-2的调控作用更为明显，几乎完全逆转了Bcl-2的降低，由此推测管花肉苁蓉对Bcl-2的调控可能主要参与了线粒体保护作用。

综上所述，本实验从线粒体信号通路探讨了管花肉苁蓉的神经保护作用，并初步阐明了分子作用机制，这对今后开发具有抗神经缺血作用的药物及相关疾病的治疗具有重要的参考意义。

［参考文献］

［1］陈孝男，杨爱琳，赵亚楠，等．缺血性脑中风的发病机制及其常用治疗中药研究进展［J］．中国中药杂志，2019，44(3):422．

［2］杨薇，黎明全，李杨，等．缺血性中风病急性期中西药群组模块探索［J］．中国中药杂志，2018，43(3):618．

［3］Bernardi P，Scorrano L，ColonnaＲ，et al．Mitochondria and cell death．Mechanistic aspects and methodological issues［J］．Eur J Biochem，1999，264(3):687．

［4］张静，赵建军，杨伟，等．基于中医证候特征的缺血性中风复发风险的横断面分析［J］．中国实验方剂学杂志，2018，24(12):194．

［5］Soustiel J F，Zaaroor M．Mitochondrial targeting for development of novel drug strategies in brain injury［J］．Cent Nerv Syst Agents Med Chem，2012，12(2):131．

［6］孙丽新，严明，江振洲，等．银杏内酯对PC12细胞缺糖损伤凋亡相关基因的影响［J］．中国中药杂志，2007，32(6):532．

［7］汤小蕾，孙平飞．管花肉苁蓉的研究进展［J］．中医药导报，2009，15(5):101．

［8］Song D，Cao Z，Liu Z，et al．Cistanche deserticola polysaccharide attenuates osteoclastogenesis and bone resorption via inhibitingＲANKL signaling and reactive oxygen species production［J］．J Cell Physiol，2018，233(12):9674．

［9］刘文静，刘瑶，宋青青，等．利用1 H-NMＲ比较管花肉苁蓉野生品和栽培品的化学成分组［J］．中国中药杂志，2018，43(17):3506．

［10］安军明，柯铁军．苁蓉总苷胶囊治疗血管性痴呆99例［J］．陕西中医学院学报，2011，34(2):36．

［11］Farajdokht F，Mohaddes G，Karimi-Sales E，et al．Inhibition of PTEN protects PC12 cells against oxygen－glucose deprivation in-duced cell death through mitoprotection［J］．BrainＲes，2018，1692:100．

［12］杜肖，路畅，贺晓丽，等．小续命汤有效成分组对脑缺血/再灌注大鼠恢复早期脑线粒体的保护作用研究［J］．中国中药杂志，2017，42(11):2139．

［13］Liu Y，Wang H，Yang M，et al．Cistanche deserticola polysac-charides protects PC12 cells against OGD/ＲP-induced injury

［J］．Biomed Pharmacother，2018，99:671．

［14］Li M，Xu T，Zhou F，et al．Neuroprotective effects of four pheny-lethanoid glycosides on H2 O2-induced apoptosis on PC12 cells via the Nrf2/AＲE pathway［J］．Int J Mol Sci，2018，19(4):1135．

［15］Chen M，Wang X，Hu B，et al．Protective effects of echinacoside against anoxia/reperfusion injury in H9c2 cells via up-regulating p-AKT and SLC8A3［J］．Biomed Pharmacother，2018，104:52．

［16］Fu Z，Fan X，Wang X，et al．Cistanches Herba:an overview of its chemistry，pharmacology and pharmacokinetics property［J］．J Ethnopharmacol，2018，219:233．

［17］骆新，李建英，许永华，等．肉苁蓉苯乙醇苷对大鼠高原脑水肿的防治作用［J］．中南药学，2014，12(8):747．

［18］魏丽丽，陈虹，姜勇，等．高效液相法测定松果菊苷在脑缺血大鼠血浆和脑组织中的浓度［J］．中国药理学通报，2011，27(5):737．

［19］陶义存，董翔，许永华，等．肉苁蓉苯乙醇总苷对高原脑水肿大鼠水通道蛋白4的影响［J］．中国现代中药，2015，17(4):302．